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第三章动植物细胞培养产酶 1 本章主要内容 第一节动植物细胞中酶生物合成的调节第二节植物细胞培养产酶第三节动物细胞培养产酶 2 概述 动植物细胞培养定义 是通过特定技术获得优良的动物和植物细胞 然后在人工控制条件的反应器中进行细胞培养 以获得所需产物的技术过程 3 概述 4 第一节动植物细胞中酶生物合成的调节 动植物细胞更复杂 调节层次更多 细胞水平个体水平 激素 神经水平 下面着重从细胞水平讨论 5 第一节动植物细胞中酶生物合成的调节 一 细胞分化改变酶的生物合成原因 基因表达具有时空性如 胰蛋白酶主要在胰细胞中合成木瓜蛋白酶主要在果皮细胞中合成端粒酶在胚胎细胞 生殖细胞 干细胞 分化程度低的癌细胞中具活性 6 第一节动植物细胞中酶生物合成的调节 2 基因扩增加速酶的生物合成即通过增加基因的数量来调节基因表达的一种方式 如 对药物的抗性 3 增强子促进酶的生物合成增强子能促进同源或异源启动基因的转录活性 4 抗原诱导抗体酶的生物合成半抗原诱导法酶蛋白诱导法 7 第二节植物细胞培养产酶 8 含酶制品 嫩肉粉 9 第二节植物细胞培养产酶 一 植物细胞的特性大生长及代谢率低营养要求简单需光对剪切力敏感生产次级代谢产物 10 第二节植物细胞培养产酶 二 植物细胞培养的特点提高产率缩短周期易于管理 减轻劳动强度提高产品质量其他 需光照等 11 第二节植物细胞培养产酶 外植体的选择和处理 愈伤组织的诱导 细胞的获取 细胞培养 分离纯化 产物 外植体的选择与处理 选择外植体 切取片段 消毒处理 植物愈伤组织 直接分离法 机械捣碎发 动作轻柔 酶分解法 纤维素酶 果胶酶等 过滤 离心分离 愈伤组织诱导法 能迅速增殖 无特定结构和功能的薄壁细胞团 外植体 半固体培养基 灭菌 冷却 生长素 分裂素 插入 培养 25 愈伤组织 1 3周 分散 接种 原生质体再生 去除细胞壁后得到的微球体 三 植物细胞培养的工艺条件及其控制 一 植物细胞培养的工艺流程 植物细胞的获取 12 第二节植物细胞培养产酶 三 植物细胞培养的工艺条件及其控制 一 植物细胞培养的工艺流程外植体 细胞的获取 细胞培养 分离纯化 产物1 外植体的选择与处理2 植物细胞的获取3 细胞悬浮培养4 分离纯化 13 第二节植物细胞培养产酶 三 植物细胞培养的工艺条件及其控制 二 植物细胞培养的培养基1 植物细胞培养基的特点与微生物培养基的主要不同点如下 1 植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐 2 植物细胞需要多种维生素和植物生长激素 3 植物细胞要求的氮源一般为无机氮源 4 植物细胞一般以蔗糖为碳源 14 第二节植物细胞培养产酶 三 植物细胞培养的工艺条件及其控制 二 植物细胞培养的培养基2 几种常用的植物细胞培养基1 MS培养基硝酸盐浓度高 广泛用于培养植物细胞 组织及原生质体 2 B5培养基铵的浓度较低 适于双子叶植物特别是木本植物的组织 细胞培养 3 White培养基无机盐浓度低 适用于生根培养 4 KM 8P培养基主要用于原生质体培养 15 第二节植物细胞培养产酶 三 植物细胞培养的工艺条件及其控制 二 植物细胞培养的培养基3 植物细胞培养基的配制为取用方便及减小误差 先配成母液保存备用 1 大量元素母液 即含有N P S K Ca Mg Na等大量元素的无机盐混合液 一般配成10倍浓度的母液 需单独溶解 按顺序搅拌混合 避免生成沉淀 2 微量元素母液 即含有B Mn Zn Co Cu Mo I等微量元素的无机盐混合液 一般配制成100倍浓度的母液 16 第二节植物细胞培养产酶 三 植物细胞培养的工艺条件及其控制 二 植物细胞培养的培养基3 植物细胞培养基的配制 3 铁盐母液 单独配制 一般采用敖和铁 通常配制成100倍浓度母液 4 维生素母液 是各种维生素和氨基酸的混合液 一般配成100倍浓度母液 5 植物激素母液 各种植物激素单独配制成母液 一般浓度为100mg L 注 一般难溶于水 需先用有机溶剂或酸 碱溶解 再用水定容 17 第二节植物细胞培养产酶 三 植物细胞培养的工艺条件及其控制 三 温度的控制 一般室温 25 左右 温度高 有利细胞生长 温度低 有利于次级代谢产物积累 四 pH的控制 一般微酸性 Ph5 0 6 0 五 溶解氧的控制 通风搅拌供给 不能太剧烈 18 第二节植物细胞培养产酶 三 植物细胞培养的工艺条件及其控制 六 光照的控制 对强度及时间有要求 七 前体的添加 前提指处于目的代谢途径上游的物质 八 刺激剂的应用 微生物细胞壁碎片 果胶酶 纤维素酶等微生物胞外酶 19 第二节植物细胞培养产酶 四 植物细胞培养产酶的工艺过程1 大蒜愈伤组织的诱导2 大蒜细胞悬浮培养3 超氧化物歧化酶的分离纯化 20 第三节动物细胞培养产酶 由于动物细胞体外培养具有明显的表达产物的优点 为传统微生物发酵所无法取代 因此 生物技术中许多有价值的生物制品 需要借助于动物细胞培养而获得 这种需求极大地促进了动物细胞培养技术的发展 21 第三节动物细胞培养产酶 早在1907年 美国的Harrison在世界上首次将蛙的神经组织在试管内培养成功 建立起动物组织体外培养的第一块基石 1950年前后 Enders及其同事发表了第一篇关于在培养细胞中生长病毒的报告 开拓了以动物病毒为研究对象的新领域 作为大规模细胞培养 Copsik等人成功的进行了有关仓鼠肾细胞的悬浮培养 22 第三节动物细胞培养产酶 随着基因工程技术的发展 人们逐渐认识到有许多基因产物不能在原核细胞内表达 它们需要经过真核细胞所特有的翻译后修饰 以及正确的切割 折叠后 才能形成与自然分子一样的功能和抗原性 使得动物细胞一跃成为一种重要的宿主细胞 用以生产多种生物制品等 这些采用大规模细胞培养技术生产贵重药品在临床诊断 治疗和预防等方面都有重要意义 23 动物细胞培养与微生物培养的不同点 a 动物细胞无细胞壁 机械强度低 适应环境能力差 b 生长速度缓慢 易受微生物污染 培养时需要抗生素 c 大多数动物细胞需附着在固体或半固体的表面生长 d 对营养要求严格 e 大规模培养时 不可简单地套用微生物培养的经验 24 第三节动物细胞培养产酶 动物细胞生长十分缓慢 并易为大多数微生物污染物所破坏 支原体对动物细胞培养的威胁最大 因为其感染力强且不易检出 因此 大规模细胞培养成功的必要条件是要有一个设备精良的细胞库 在细胞库中的冷冻细胞不受污染 25 第三节动物细胞培养产酶 动物细胞培养基的配方十分复杂 并且还需补充血清 原料的质量控制和培养基的生产是大规模细胞培养的主要问题 因为血清来源困难 质量不稳定 残留血清给产物提纯带来困难等 26 第三节动物细胞培养产酶 动物细胞培养主要用于生产下列功能蛋白质 疫苗激素多肽生长因子酶单克隆抗体非抗体免疫调节剂 狂犬病疫苗 培养VERO 非洲绿猴肾细胞 生产 重组人白细胞干扰素 27 一 动物细胞的特性 1 没有细胞壁 细胞适应能力差 十分脆弱 2 体积比微生物大 比植物细胞稍小 3 相互粘连以集群形式存在 4 营养要求复杂 培养基一般要添加血清 28 二 动物细胞培养的特点 1 主要用于功能蛋白质和多肽的生产 2 生长较慢 15 100h 3 需要添加抗生素以防染菌 4 无细胞壁 体积较大 对剪切力敏感 要求严格控制培养条件如通风 搅拌 pH 渗透压等 5 大部分动物细胞有锚地依赖性 需要贴壁培养 6 培养基成分复杂 分离纯化复杂 成本较高 多用于高价值药物的生产 7 原代细胞培养50代之后即会退化死亡 需要重新分离细胞 29 三 动物细胞培养方式 1 悬浮培养 血液细胞等对剪切力敏感2 贴壁培养 上皮 成纤维细胞等 滚瓶培养微载体培养3 固定化细胞培养吸附法包埋法 培养瓶 CGIII 12悬浮 贴壁培养细胞转瓶机 30 细胞培养微载体系统 31 四 动物细胞培养的工艺条件及其控制 工艺流程 制备细胞悬液 接种 培养 收集培养液 分离纯化目的物 32 培养动物细胞的步骤 1 无菌取出目的细胞所在的组织用培养液漂洗干净 2 用无菌刀割掉多余部分并切成小组织块 3 小组织块置于解离液中离散细胞 4 低速离心洗涤细胞后 将目的细胞吸移到培养瓶中 33 动物细胞培养 34 小鼠组织块 用胰蛋白酶处理后变成单个细胞 24h后 贴壁生长 的成纤维细胞 35 一 动物细胞培养基的组成成分 氨基酸 必需氨基酸谷氨酰胺作碳源及能源维生素血清提供或补充B族维生素 Vc等无机盐调节渗透压 提供必需元素等 葡萄糖作碳源及能源激素维持正常的分裂与代谢 血清提供或添加 生长因子血清提供或添加 36 二 动物细胞培养基的配制 自制 配制母液并过滤除菌备用无血清培养基特定营养成分的添加购买 商品化培养基 细胞培养用小牛血清 无血清动物细胞培养基 Wako 和光纯药 细胞培养无血清培养基SericinGIT 37 三 温度的控制 温度影响生长与代谢36 5 0 25 温度影响pH 通过影响CO2的溶解度影响pH 38 四 pH的控制 一般控制在pH7 0 7 6微碱性范围 通常pH7 4下生长最好 调节方法 通常用CO2与NaHCO3维持pH稳定 缓冲系统CO2与NaHCO3系统 柠檬酸与柠檬酸盐系统等pH监测 酚红指示剂pH7 6蓝红色pH7 4红色橙色pH7 0黄色pH6 5 39 五 渗透压的控制等渗溶液700 850kPa 六 溶解氧的控制量 过多过少都不行控制 通过调节进入反应器的混合气体的量及其比例调剂控制溶解氧 混合气体含4种气体 空气 氧气 氮气 二氧化碳 40 五 动物细胞培养