紫外线诱变.doc

实训一 应用紫外线诱变选育抗药性的淀粉酶生产菌株一、实训目的（1）学习并掌握物理诱变育种基本技术。（2）观察紫外线对枯草芽孢杆菌产生淀粉酶的诱变效应。二、实训原理物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普通，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。一般用于诱变育种的物理因子有快中子、60Co、-射线和高能电子流-射线等。紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。因此，对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。紫外线的波长在200380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。紫外线诱变一般采用15W或30W紫外线杀菌灯，照射距离为2030cm，照射时间依菌种而异，一般为13min，死亡率控制在5080为宜。被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌BF7658。首先筛选出抗药性(抗氨苄青霉素)变异株，再进一步用琼脂块透明圈法初筛，选择淀粉酶活力有明显提高的生产菌株。三、实验材料(一) 菌种枯草芽孢杆菌BF7658。(二) 培养基(见附录)肉膏蛋白胨固体培养基、淀粉培养基。(三) 主要药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、碘液。(四) 主要器皿试管、移液管、锥形瓶、量筒、烧杯、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机等。四、实验内容(一) 诱变1. 菌悬液的制备取已培养20 h 的活化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块，离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。2. 平板制作将淀粉琼脂培养基熔化后，冷至45左右倒平板。3. 诱变处理(1) 预热 正式照射前开启紫外灯预热10 min。(2) 搅拌 取制备好的菌悬液4 mL 移入6 cm 的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌捧，置磁力搅拌器上，20 W 紫外灯下30 cm 处。(3) 照射 然后打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为1min，2min，3min。可以累积照射，也可分别照射不同时间。所有操作必须在红灯下进行。4. 稀释涂平板在红灯下分别取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5 mL 进行不同程度的稀释。取最后3 个稀释度的稀释液涂于淀粉培养基平板上，每个稀释度涂3 个平板，每个平板加稀释液0.1 mL，用无菌玻璃刮棒涂匀，37培养48 h(用黑布包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度、组别、座位号。(二) 计篡存活率及致死率1. 存活率将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。存活率=处理后mL菌液中活菌数对照1mL菌液中活菌株100致死率=对照1mL菌液中活菌数-处理后1mL菌液中活菌数对照1mL菌液中活菌数100同样计算用紫外线处理1、2、3min 后的存活细胞数及致死率。三）观察诱变效应在平板菌类计数后，分别向菌落数在56 个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈，分别测量透明圈直径与菌落直径并计算比值(HC 值)，与对照平板进行比较. 根据结果说明紫外线对枯草芽孢杆菌产淀粉酶诱变的效果，选取HC 比值大的菌落移接到新鲜牛肉膏斜面上培养。此斜面可作复筛用。五、实验报告内容（一）将实验结果按表要求如实填入，并分别算出存活率，致死率。表1 紫外线处理后枯草芽孢杆菌的存活率及致死率(二) 测量经UV 处理后的枯草芽孢杆菌菌落周围的透明圈直径与菌落直径并计算比值(HC)与对照菌株进行比较附录肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 0.5 g蛋白胨 1.0 gNaCl 0.5 g水 100 mLpH 7.2100 Pa 灭菌20min。如配制固体培养基需加琼脂1.5%2%；如配制半固体培养基则加琼脂0.7%0.8%。淀粉培养基蛋白胨 1 gNaCl 0.5 g牛肉膏 0.5 g可溶性淀粉 0.2 g琼脂 1.52 g蒸馏水 100 mLpH 7.2配制时，应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。100Pa 灭菌20 min。碘液碘 1 g碘化钾 2 g蒸馏水 300 mL配制时，先将碘化钾溶于510 mL 水中，再加入碘1 g，使其溶解后，加水至300 mL。 宝宝 巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸巴巴爸爸微生物工程实验一 淀粉酶产生菌的紫外线诱变育种实验目的要求1. 掌握紫外线诱变育种的原理和方法步骤 2. 了解淀粉酶活力测定方法 实验原理 紫外线是一种常用的物理诱变剂，它能引起DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而导致基因突变。由于存在光复活作用，故辐照和处理后的培养应在红光下操作。 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括-淀粉酶、-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。枯草杆菌产生的主要是 -淀粉酶，能够随机切开淀粉链的-1，4-糖苷键，将淀粉水解为葡萄糖、寡糖和糊精。实验材料菌株: 枯草杆菌As1.15培养基及试剂：0.8-0.85%生理盐水 ， 淀粉培养基（固体）， 牛肉膏蛋白胨（液体）， 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 碘液 2%可溶性淀粉 标准终点色溶液仪器：离心机，超净工作台，移液枪，电炉实验步骤整个实验流程，分为两部分： UV诱变处理及结果观察 -淀粉酶活力测定诱变流程收集枯草杆菌培养物用无菌生理盐水洗涤1次制备108cells/ml菌悬液稀释对照菌液取10-4、10-5 、10-6涂布平板，37度培养48 h 数菌落计算菌浓暗室中UV处理2 min 红灯下稀释菌液 取10-3、10-4、10-5涂布平板37度培养48 h 数菌落计算致死率实验安排一1. 收集菌（芽孢）液，并用生理盐水洗涤、重悬 2. 显微镜直接计数，调整细胞（芽孢）浓度至约108/ml 3. 倒淀粉培养基平板 4. 打开紫外灯预热20min，然后紫外线处理菌悬液（5ml，直径7cm平皿，13min） 5. 稀释（至105，即稀释5次） 6. 涂平板（取后3个稀释度，每稀释度2皿，每皿加菌液100ul） 7. 倒置培养，37培养48小时 实验安排二1. 分别计数诱变组和对照组平板上菌落数，并计算致死率 2. 观察诱变效应：加入碘液，分别测量诱变组和对照组1020个菌落的透明圈直径和菌落直径，并计算比值，求平均数；将诱变组和对照组数据作比较 3. 接种、培养：选取诱变组透明圈直径和菌落直径比值较大的菌落（菌株）3个，分别接种牛肉膏蛋白胨斜面，培养3天后，转接牛肉膏蛋白胨液体培养基进行发酵。 实验安排三1. 发酵液经5000rpm离心10min，取上清作为供试酶液 2. 取2ml标准终点色溶液滴于白瓷板空穴内，作为比较颜色的标准 3. 取5ml 2%可溶性淀粉和5ml 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液于大试管中，60恒温水浴中预热45min。然后加入酶液1ml，立即记录时间，充分摇匀。定时用滴管取反应液约0.5ml，滴于预先充满比色稀碘液(约1.5ml）的磁板空穴内，当与标准终点色相同时，即为反应终点，并记录时间t (min) 4. 计算酶活 酶活用1ml酶液于60，pH6.0的条件下，1h液化可溶性淀粉的克数来表示g可溶性淀粉/mlh 酶活力单位= 60/t52%思考题1. 使用紫外线对菌（芽孢）悬液进行诱变时，为什么要用磁力搅拌器？ 2. 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？ 实验报告一 实验目的二 实验原理三 实验材料与仪器四 实验步骤五 实验结果六 讨论七 注意事项八 思考题附录：试剂及培养基1. 洗涤及悬浮用0.8-0.85%生理盐水50ml； 2. 无菌水一瓶； 3. 淀粉培养基（固体）：每瓶250ml，4瓶 蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，H2O 1000ml， pH7.2；琼脂15g； 4. 牛肉膏蛋白胨（液体）：500ml三角瓶装80ml，12瓶 牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，H2O 1000ml，pH值7.0； 5. 牛肉膏蛋白胨斜面：3支*4=12支； 6. 0.02mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4H2O）4.52g和柠檬酸(C6H8O7H2O)0.807g，用蒸馏水溶解定容至100ml，配好后应以酸度计或精密试纸校正pH； 7. 2%可溶性淀粉 精确称取2g可溶性淀粉（以绝干计），然后用少量蒸馏水调匀，徐徐倾于煮沸的蒸馏水中，加热煮沸至透明为止，冷却定容至100ml。（注意：此溶液需当天配置）； 8. 碘液：0.022g碘，10g碘化钾，先用少量蒸馏水使碘完全溶解后定容至250ml，贮存于棕色瓶中 9. 标准终点色溶液 A液：精确称取氯化钴（CoCl6H2O）4.02439g和重铬酸钾（K2Cr2O7）0.04878g，以蒸馏水定容至50ml。 B液：精确称取铬黑T（C20H12N2NaO7S）5mg，以蒸馏水溶解定容至50ml。 使用时取A液40ml与B液50ml混合。此混合液宜冰箱保存，使用15天后需要重新配制。实验8-17紫外线的诱变育种 字体 大 中 小紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯， 波长为2537。 灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。紫外线的剂量若灯的功率为30W，距离为30cm时，每平方毫米每秒为53 10-7J。一般我们常以细胞的死亡率表示。例如，我们希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。 被照射的菌悬液细胞数， 细菌为108个/ml左右， 霉菌孢子和酵母细胞为106107个/ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5 1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。 (一) 实验材料 1. 菌种 枯草杆菌AS 1.398。在肉汁蛋白胨培养液中摇瓶培养1820h。 2. 培养基 牛肉汁蛋白胨固体和液体培养基。 3. 无菌生理盐水。 4. 15W紫外灯。 5. 磁力搅拌器。 6. 摇床(或恒温振荡器)。 7. 漏斗、三角瓶、玻璃珠等。 (二) 操作步骤 1. 将细菌培养液以3000r/min离心5min，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心洗涤。 2. 将菌悬液放入一已灭菌的、装有玻璃珠的三角瓶内用手摇动，以打散菌体. 将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达103个/ml左右，作为待处理菌悬液。 3. 取24ml制备的菌液加到直径9cm培养皿内，放入一无菌磁力搅拌器，然后置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处. 在正式照射前，应先开启紫外线10min，让紫外灯预热，然后开启皿盖正式在搅拌下照射1050 s。操作均应在红灯下进行，或外用黑纸包住，避免白炽光。 4. 取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释分离，计数活菌细胞数。 5. 取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装30ml培养液)， 120r/min振荡培养46h。 6. 取中间培养液稀释分离、培养。 7. 挑取菌落进行筛选。 字数 917 光复活作用是指紫外线产生的损伤，可以用波长更长的光照射使损伤恢复的现象，又称为光重激活作用、光逆转、光恢复等。 这种现象早在本世纪初就有报道，但是真正认识光复活作用的是Kelner，1949年他发现用紫外线照射引起的黄色链霉菌孢子以及大肠杆菌的失活，可以用可见光使之恢复。同年Dulbecoo发现大肠杆菌的嗜菌体也有光复活作用。此后，光复活作用的研究就广泛地开展起来了。 光复活现象 光复活作用是一种普遍的生物学现象。主要表现在微生物、单细胞植物与原生动物，但在多细胞及高等动植物的某些生理过程中，例如酶活性、植物细胞中的等电点，以及叶绿素含量等方面也有光复活作用。 对四类不同微生物用253.7nm波长照射使其致死，然后用500W的可见光照射1045min，结果有明显的光复活效应，表中表明了存活率的变化。 不同微生物的光复活效应微生物类型放线菌链霉菌细菌大肠杆菌霉菌青霉菌真菌酵母菌紫外线照射光复活2.110-66.610-14.510-61.210-15.510-42.510-11.110-51.110-5但是也发现芽孢杆菌和固氮菌以及乳酸菌属没有光复活现象，前者是因为它们对光敏感，后者是因为需要较复杂的营养条件，所以仅仅满足光条件还不能使其恢复。 用223300nm波长的远紫外线照射，对团藻的纤毛运动及整个细胞的运动可产生两种不同的抑制： 一种是照射后立即出现抑制，其作用光谱与蛋白质的吸收光谱一致; 另一种是照射后一周才出现抑制，其作用光谱与DNA的吸收光谱一致。这两种抑制作用都可以在照射后自动恢复，达到原来活动程度的60%，但如用500580nm波长的光照则可使其运动完全恢复。 1958年Rupert与Goodgal首次进行了体外试验。他们从嗜血流感菌的抗链霉素菌株中提取DNA作为转化因子，加入到对链霉素敏感的菌株的培养基中，可使许多细胞对链霉素由敏感转变成有抗性。若将DNA提取物在加入培养基前，用254nm波长的紫外线照射，则DNA的转化能力就减弱或消失。但是，若将紫外线照射过的DNA与大肠杆菌提取液放在一起，并加入Mg+再照光，DNA的转化能力就恢复。若紫外线照射过的DNA不与大肠杆菌提取液放在一起，单独照光就不能恢复转化能力。以后，Rupert又在酵母提取液中发现此现象，进而从酵母液中分离出一种酶，这种酶与光有密切关系，称为光复活酶。 光复活作用的特点 一般认为在紫外线照射停止后，立即照射可见光才有效，时间间隔愈长，效果愈差。在一定温度范围内，照射时温度愈低，则在增加温度后，其光复活效率也愈高，说明过程中有暗反应存在。但光复活作用并不以氧为条件，同样也不受氰化钾抑制，这说明它是一种光化学过程。光复活作用中损伤光的波长一般为220300nm，若加长波长损伤光本身就可能成为复活光，复活光波长一般认为在3