3拷贝数变化数据分析.doc

Copy Number Data Analysis1. 什么是基因拷贝数基因拷贝数是指某一种基因或某一段特定的DNA序列在单倍体基因组中出现的数目。基因拷贝数变异（CNV）是指较之于参照基因组,DNA片段缺失或复制大于1kb至Mb的结构变异，是基因多态性的一种。在肿瘤细胞中DNA拷贝数的变化：如正常人类基因组构成成分是成对存在，即2个拷贝。肿瘤细胞在细胞分裂过程中出现因缺失或重复而导致的基因拷贝数变化，可以变少如0、1，也可能增加至大于2的拷贝数。2、怎样测量/定量基因拷贝数1）Q-PCR：DNA扩增，最简单，最初的方法即时聚合酶链锁反应（Real-time polymerase chain reaction，简称 Real-time PCR、即时PCR），又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 Q-PCR/qPCR/qrt-PCR、定量即时PCR、即时定量PCR），是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法。比较CT值确定拷贝数。2）传统细胞遗传学技术FISH（Fluorescence In situ Hybridization 荧光原位杂交）或 SKY在单细胞水平检测基因重排（插入/删除/转移），低分辨率（40 -250 kb per clone）将DNA探针用生物素和毛地黄毒苷等荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异结合，通过荧光杂交信号来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分析。 3)CGH(Comparative Genomic Hybridization 比较基因组杂交)定义：将消减杂交、荧光原位杂交相结合，用于检测DNA序列的变化(缺失、扩增、复制)，并将其定位在染色体上的方法。基本原理：用不同的荧光染料分别标记正常人基因组DNA与肿瘤细胞DNA，然后与正常人中期染色体杂交，通过检测染色体上两种荧光（红、绿）的相对强度比率，两组DNA相异部分会显出颜色偏移，可计算出DNA的缺失与放大，从而了解肿瘤组织DNA拷贝数的改变，并能同时在染色体上定位。CGH 只能检测不平衡的染色体改变。结构染色体变异，例如：平衡的相互易位或倒位不能被检测出来，因为拷贝数没有变化。事先不知道染色体位置也可以检测染色体的缺失和增加，也能够定量4)Array-based CGH（微阵列比较基因组杂交）arrayCGH的特点基因芯片又称DNA探针微阵列（microarray），它通过在一微小的基片表面固定大量的基因探针，待检测样品标记后与已固定的核苷酸序列进行杂交，根据检测信号的有无和强弱，确定样品中该基因或核苷酸序列的含量。ArrayCGH实际上就是用微阵列取代传统CGH的中期分裂相，使荧光标记的测试DNA探针和参照DNA探针竞争性地与微阵列上的短片段靶序列杂交。根据被检组织基因组的大小和实验要求，微阵列上的核苷酸靶序列可来源于不同的基因组文库，如YAC（0.2-2Mb）,BAC(300kb左右)，P1(70-100kb), PAC(130-150kb)和cosmid(30-45kb)等文库。与传统的CGH相比，arrayCGH技术在以下两方面具有明显的优势：（1）灵敏度和精确性：由于染色体上的DNA是以高度密集和超螺旋的形式存在着，因此传统CGH只有在DNA序列缺失达1020Mb（细胞株）或2030Mb（原发肿瘤）以上或序列扩增时扩增子与扩增拷贝数之积至少2Mb才能被检测出来。故传统CGH所提供的信息中必然包含为数众多的基因，需要作进一步的精确定位。arrayCGH避开了复杂的染色体结构，所杂交的靶序列仅为包含了少数基因的一段段短DNA片段，所以能找出传统CGH检测不出的DNA序列拷贝数的差异，并同时将扩增或缺失的范围精确地定位在某个或某几个已知基因或EST上。（2）自动化、程序化：染色体带型的复杂性和个体差异决定了核型分析不可能全部实现机械化，必需依靠经验丰富的细胞遗传学家对核型分析软件得出的结果进行校正后才能进一步分析基因组的不平衡性。因此传统的CGH技术受人为因素的限制，需要一定的经验技术和劳动力支持。ArrayCGH技术中不需要染色体核型的制备和分析，与普通的基因芯片检测表达谱的过程一样，其结果完全可以由机器和计算机自动操纵控制，既快速又直观。Array-based CGH与CGH比较，Array-based CGH具有以下优点：分辨率更高，灵敏度更高，边界检测准确，拷贝数计算精确，价格实惠（一般都用芯片即微距阵做）Array-based CGH数据分析流程：Array-based CGH平台：1. BAC array2. in-situ synthesized Oligo arrays (NimbleGene, 4.2M probes)3. Printed long Oligo arrays (Agilent CGH arrays, 1M probes)4. SNP arrays ( Affymetrix 6.0 and Illumina bead arrays)5)靶向性或全基因组测序优点：可以检测到核苷酸水平。缺点：成本太高。以上方法中，Array-based CGH 是最普遍的方法。预测拷贝数变化的方法：Segmentation（分割？）：对信号峰进行一些处理，优化信号CN Estimation（拷贝数估计）: Hidden Markov Model (HMM 隐马尔科夫模型)，不能用于癌症研究用单核苷酸多态性微矩阵分析基因拷贝数和杂合性缺失LOH（杂合性缺失）：实际就是杂合子，一对染色体上某一个染色体上基因缺失，与之配对的染色体上仍然存在。个体层面分析对单个个体样品或单对样品进行分析a. 对基因拷贝数的放大和删除的显著性检验b. 寻找边界（平滑和分割）c. 拷贝数估计群体水平分析对整个群体或亚群样品进行分析a. 总体显著性水平检验b. 拷贝数放大和删除频率总结c. 寻找变化的常见/并发区域d. 联系（与突变、杂合性缺失、临床变量等进行综合分析）与基因表达谱相联系寻找影响基因表达谱的拷贝数变化，尤其是有大片增加和缺失的区域。如果拷贝数变化发生在整个染色体上，如整个染色体缺失，但在缺失前染色体上的基因并不是全部都表达。将拷贝数变化情况与基因表达谱进行对照，找出表达下调的基因，则这些基因的下调就有可能是由于该染色体缺失造成的，但也可能是其他原因造成的。3.用到的一些软件Affymetrix Chips ()Illumina Chips ()CNAT(); dChip (): copy number and LOH for SNP arrayCNAG (www.genome.umin.jp)Plink: CNV association analysisGenePattern /cancer/software/genepattern/BioConductor R Packages ()GLAD package, adaptive weights smoothing (AWS) methodDNAcopy package, circular binary segmentation