干旱胁迫对植物生理生化指标的影响.docx

干旱胁迫对植物生理生化指标的影响摘要：水是生命之源，地球上任何生物的生存都离不开水。并且，很多生物在出现缺水时都表现出一系列相应的症状，特别是植物最明显。植物常常遭受的有害影响因素之一就是缺水，当植物消耗的水分无法从外界得到补充时，就会使植物体内的一些生理生化指标发生变化，如脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)等的含量。实验通过分光光度计分别在不同的波长中测出吸光率，间接计算出其含量，我们通过测定这些指标含量的变化就可以知道干旱对植物的损伤有多严重。植物经常遭受干旱胁迫的危害，全世界干旱、半干旱地区的面积占总面积的43%，而中国更为严重，约占51.9%，因而研究植物的抗旱性尤为重要。由实验数据可知，当小麦受到干旱胁迫时，小麦幼苗的脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)的含量均升高。关键词：干旱、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽(GSH)1. 引言1.1 干旱及干旱对植物的影响干旱化已成为世界性的问题，中国干旱半干旱地区面积为2566104km2，占国土面积的26.73。在我国各干旱省份中，云南又属于干旱的省份之一。对植物影响的诸多自然因素中，干旱占首位。因此研究干旱对植物的影响就尤为重要，以利于应用于农作物上。在农业上可以采取植物的各种抗旱机制来抵抗干旱对农作物的损伤，才不致使庄稼减产，利于丰收。那么，究竟什么算干旱呢？就让我们来看看它的定义吧！当植物耗水大于吸水时，就会使组织内水分亏损，简而言之，过度水分亏缺的现象，称为干旱。干旱可分为大气干旱和土壤干旱。土壤干旱时，植物生长困难或完全停止，受害情况比大气严重 。我国农业每年受旱灾面积达2500多万km2。1 水分在植物的生命活动中起着极大的作用,全世界由于水分亏缺导致的减产超过其他因素造成的减产的总和2。大多数植物遭受干旱逆境后各个生理过程都会受到不同程度的影响。随着干旱时间的延长，植物可吸收的水分越来越少。因此，植物的一些生理生化指标都发生了一定程度的变化。1.2 实验的目的及意义希望可以通过本次实验让我们掌握干旱胁迫下植物的一些生理生化指标的测定方法，并且通过测定这些指标含量的变化来了解干旱对植物的伤害有多严重，及干旱胁迫对植物的伤害原因及研究其抗旱机理。当知道植物的抗旱机制后我们就可以利用其抗旱机制，采取相应的措施来保护植物了，特别是一些农作物和一些景观植物。2. 材料与方法2.1材料植物材料：小麦种子、玉米种子；主要试剂：0.1% HgCl2 ，TTC，3%磺基水杨酸（SSA），冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8) ，0.6%TBA（用0.6% TCA配制）， PBS (pH=6.8，内含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制 ，PBS,（pH=5.8,内含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP）， POD反应混合液（10 mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解），PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙酸，PBS (pH=7.7) ，4 mM DTNB (用0.1M pH=6.8PBS现配)。主要仪器：分光光度仪，离心机，试管，微量加样器，研钵等。2.2 实验种子的处理：品种为晴3或鲁玉13的玉米种子或小麦种子（购于西山种子公司） 用0.1% HgCl2消毒10 min后 用蒸馏水漂洗干净 用蒸馏水于26下吸涨12 h 播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm16cm）中 于26下暗萌发60 h 计算发芽率（注意与前面结果比较） 选取长势一致的玉米幼苗做干旱5天、高温、盐渍或低温下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。种子发芽率的测定： 各取50粒吸胀的玉米种子或小麦种子沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验： 其中50个半粒进行TTC染色（30水浴 20 min），取50个半粒进行曙红染色（室温染色10 min）洗净后观察。根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。2.3 实验方法及步骤（1）、脯氨酸(Pro)含量的测定Pro的提取：分别取0.1 g实验组和对照组的幼苗加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂充分研磨用2 mL 3% SSA洗研钵5000 rpm离心10 min 量上清液体积。测 定：上清液各2 mL 分别加入 2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂煮沸15 min冷却后5000 rpm离心10 min（若没沉淀可略此步骤） 分别测定A520计 算：（2）、丙二醛(MDA)含量的测定MDA提取：分别取0.1 g实验组和对照组加入3 mL 10% TCA 和少许石英砂充分研磨用2 mL 10%TCA洗研钵5000 rpm离心10 min 量上清液体积。测 定：分别取上清液各2 mL 加入0.5%TBA（用10%TCA配制） 2 mL煮沸15 min冷却后5000 rpm离心5 min （视沉淀有无）分别测定OD450和OD532。计 算：OD450 = C185.4OD532 = C17.4155000C2解得：C1（mmolL）=11.71 OD450C2（mmolL）= 6.45 OD532 - 0.56 OD450(式中，C1为可溶性糖浓度，C2为MDA的浓度。)（3）过氧化氢(H2O2)含量的测定H2O2提取：分别取0.1 g实验组和对照组加入3 mL 0.3%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂充分研磨用2 mL TCA洗研钵5000 rpm离心10 min 量上清液体积。测 定：分别取上清液各4 mL 加入0.1%Ti(SO4)2 用20%(v/v) H2SO4配制0.2 mL摇匀 OD410计 算：（4）、抗氧化酶含量的测定抗氧化酶的提取：分别取0.1 g实验材料加入少许石英砂和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,内含0.mmol/ LEDTA, 1%PVP） 充分研磨转入离心管中用2 ml提取液洗研钵 5000 rpm离心10 min 量上清液体积用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80保存。 （5）、多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)含量的测定POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）3 ml，加入酶液50l（空白调零用提取液取代），立即记时，摇匀，读出反应0.5和1.5 min时的A470。PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）3 ml，加入酶液0.1 ml（空白调零用提取液取代），立即记时，摇匀，读出反应0.5和1.5 min时的A410。 以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：（6）、谷胱甘肽(GSH)含量的测定GSH的提取：分别取0.1 g实验组和对照组的幼苗加入3 mL 3%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂充分研磨用2 mL 3% TCA洗研钵 5000 rpm离心10 min 量上清液体积。测 定：上清液各2 mL (空白用3%三氯乙酸代替) 分别加入0.4 mL1M NaOH 1 mL 2 mM DTNB 25 5 min测定A412计 算：3. 实验结果及分析：（1）发芽率的测定：小麦：TTC 染色法：48个具有活力，因此其发芽率为：48/50100%=96%；曙红染色法：50个具有活力，因此其发芽率为：50/50100%=100%。玉米：TTC 染色法：45个具有活力，因此其发芽率为：45/50100%=90%；曙红染色法：47个具有活力，因此其发芽率为：47/50100%=94%。分析：两种方法测定的发芽率不一样，可能是因为：由数据可以看出，TTC染色的种子发芽率普遍比曙红染色的低，可能是因为TTC染色法的染色部位是胚，曙红染色法的染色部位是胚乳，并且在种子中胚比胚乳小很多，有的种子被虫吃了一部分，或者是切种子的时候另一半没有切到胚，影响观察结果，所以TTC染色的发芽率比曙红染色的低。（2）脯氨酸（Pro）含量测定：A520 V总 V显 V用 Procontent干旱组1.296 4.6ml 6ml 2ml 55.20 m mol.g-1FW对照组0.047 4.9ml 6ml 2ml 2.13 m mol.g-1FW计算过程：根据公式： （式中=3.24 mol.cm，L=1cm,W=0.1g） 带入数据可求得Pro content。计算结果为干旱组脯氨酸含量为55.2 mmol.g-1FW，对照组脯氨酸含量为2.13 m mol.g-1FW.实验组与对照组比较，可以看出实验组的脯氨酸含量是对照组的25.9倍左右，表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中Pro含量迅速上升。（3）丙二醛（MDA）含量的测定：OD532 OD450 C1 C2干旱组0.347 0.954 11.170mmol/L 1.704mmol/L对照组0.043 0.051 0.597 mmol/L 0.249mmmol/L计算过程：根据公式：OD450 = C185.4OD532 = C17.4155000C2解得：C1（mmolL）=11.71 OD450C2（mmolL）= 6.45 OD532 - 0.56 OD450(式中，C1为可溶性糖浓度，C2为MDA的浓度。)可计算出C1， C2的值。计算结果为干旱组的MDA的浓度为1.704 mmol/L，对照组的MDA的浓度为0.249mmol/L，干旱组为对照组的6.8倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中MDA含量比正常生长的含量高。（4）H2O2测定：V总 V用 V显 OD410 H2O2 content干旱组4.8 ml 4 ml 4.2 ml 0.638 9.924 m mol.g-1FW对照组4.7 ml 4 ml 4.2 ml 0.476 2.305 m mol.g-1FW计算过程： 根据公式： （式中=3.24 mol.cm，L=1cm,W=0.1g） 带入表中的数据即可算出H2O2 content。计算结果得到干旱组中H2O2为9.924 umol.g-1FW，对照组中H2O2为2.305 umol.g-1FW，干旱组为对照组的4.3倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中H2O2含量上升。（5）POD的测定: V总 V显 V用干旱组 5.5ml 3.05ml 3ml对照组 5.2ml 3.05ml 3mlPOD在不同时间的A470值： 0.5 min 1.5 min POD activities（t=0.5min）POD activities(t=1.5min)干旱组 0.112 0.253 3.87umol.g-1FWmin-1 2.91umol.g-1FWmin-1对照组 0.097 0.228 3.17umol.g-1FWmin-1 2.48umol.g-1FWmin-1计算过程： 根据公式： （式中=3.24 mol.cm，W=0.1g） 可计算分别出POD activities。由上表可知，当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，过氧化物酶（POD）含量上升。（6）PPO的测定：V总 V显 V用干旱组 5.1ml 3.1ml 3ml对照组 4.7ml 3.1ml 3mlPPO在不同时间的A410值：0.5 min 1.5 min PPO activities（t=0.5min） PPO activities（t=1.5min）干旱组 0.1210.139 411.4U.g-1FW 157.5U.g-1FW对照组 0.1020.109 319.6U.g-1FW 113.8U.g-1FW计算过程： 根据公式： 可算出PPO activities。由上表可知，当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，多酚氧化酶(PPO)含量明显上升。（7）GSH的测定： V总 V用 V显 A412 GSH content干旱组 4.1ml 2ml 3.4ml 0.802 17.25 umol.g-1FW对照组 4.4ml 2ml 3.4ml 0.111 2.56 umol.g-1FW计算过程： 根据公式： （式中=3.24 mol.cm，L=1cm,W=0.1g） 带入表中的数据即可算出GSH content。由上述计算结果可知受到干旱胁迫的小麦幼苗的胚芽鞘中GSH含量是正常生长的6.7倍左右，表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中GSH含量上升。4. 讨论：16测定玉米发芽率时所用的两种方法：TTC染色法和曙红染色法。TTC染色法的染色部位是胚，染色较深，能清晰判别胚的死活，曙红染色法的染色部位是胚乳，着色较浅。实验中玉米用两种方法都发现有部分玉米种子的胚和胚乳被虫吃了一部分，虽然能被染色，但是在实际栽培中很难发芽，因此，这些种子判断为不能正常发芽生长，但总体来说这批种子发芽率还是很高的。大量研究证实，水分胁迫下植物组织内脯氨酸含量有普遍增高的现象3， 有些研究表明脯氨酸累积的高低可以作为植物抗逆性筛选的指标4，有些研究结果认为逆境下脯氨酸含量的积累是植物受伤害的结果，不宜作为抗性筛选的指标。该试验表明，在水分胁迫下，小麦幼苗脯氨酸（Pro）含量均有不同程度地高于对照，呈增长的趋势。丙二醛（MDA）作为膜脂过氧化的重要产物，其含量与质膜相对透性具有相关性，是衡量植物受伤害程度的指标之一，有研究认为，丙二醛质量摩尔浓度与植物抗旱性密切相关，但丙二醛大量增加时，表明体内细胞受到较严重的破坏5。一般来说，MDA含量越高，表示植株受伤害程度越大。过氧化氢(H2O2)是植物代谢中产生的一种产物，其积累对细胞具有氧化破坏作用，在实验中，可根据其值的变化，来了解组织的破坏程度。因此，过氧化氢的含量也是植物逆境的一项指标。水分胁迫等逆境条件使细胞活性氧代谢失调，O2和H2O2等活性氧累积并超过膜伤害临界值，从而导致膜脂过氧化作用加剧，但植物可通过内源性保护性酶促清除系统清除过多的活性氧，以保证细胞的正常机能。H2O2在本次试验中的结果是，干旱组的含量更高些。过氧化氢酶大量分布于动植物细胞内，属于活性氧清除剂，对H2O2和羟自由基有清除能力，是一种细胞保护酶。细胞内的保护酶系统主要有超氧化物歧化酶和过氧化物酶等。酶活性越高，消除自由基的能力也越强，植物的抗逆性也越强 5,6。耐旱植物在适度的干旱条件下酶活性通常增高，清除酶活性氧的能力增强。PPO和POD均为植物内源自由基清除剂，属于保护酶系统7。在逆境中保护酶活性增强或维持较高的水平，能够清除活性氧自由基使之保持较低的水平，维持细胞膜的稳定性和完整性。在干旱胁迫下，由于抗氧化酶与ROS的动态平衡被打破，造成抗氧化酶（PPO、POD）的积累。在干旱胁迫下PPO、POD含量上升，POD催化其它底物与H2O2反应以消耗H2O2植物在受水分胁迫及时复水，可诱导体内POD活性上升，从而起到保护植物的作用。POD活性在干旱胁迫下增强,能通过增强POD活性来抵御干旱逆境对其所造成的伤害8。多酚氧化酶(PPO)是植物体内酚类物质氧化或缩合以及木质素合成的重要酶，提高PPO活性可促进植株体内酚类物质和木质素的合成和累积以提高植物抗性9。由实验结果可知，本实验中POD、PPO含量均上升，在干旱胁迫下，小麦幼苗的过氧化物酶(POD )活性都有所增加。实验结果表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中GSH含量迅速上升，干旱胁迫的小麦幼苗的GSH含量是正常生长的7倍左右。在植物体内活性氧的清除包括酶系统与非酶系统，而谷胱甘肽（GSH）则是非酶系统中活性氧清除的重要抗氧化剂之一。GSH不仅可以直接清除H2O2，在叶绿体中还可以与抗坏血酸协同作用清除H2O2。对于GSH含量的测定，是一个良好的表示抗氧化胁迫的指标。研究表明在水分胁迫下，GSH含量能增加至50倍以上，可提高植物的抗氧化能力10。谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸组成的天然三肽是一种含硫基的化合物，本实验结果表明干旱胁迫下谷胱甘肽含量比正常的显著升高，说明谷胱甘肽含量的升高使植物抗旱性增强。这次实验表明在干旱胁迫下,小麦幼苗生长受到一定抑制作用,生理生化指标发生一系列变化,表现为小麦幼苗中脯氨酸、丙二醛(MDA)、H2O2、GSH、过氧化酶（POD、PPO）、GSH含量在干旱胁迫下含量较正常情况下的明显升高（尤其是Pro和PPO的含量升高的幅度极显著），保护小麦的组织不受伤害，以提高小麦的抗旱能力。从总体上看，经胁迫后的小麦抗逆性强于正常生长的小麦。5.参考文献：1 潘瑞炽.植物生理学.第七版.高等教育出版社出版.2012：334-336.2 汤章城.植物对水分胁迫的反应和适应性1.抗逆性的一般概念和植物的抗涝性J.植物生理学通讯,1983,(3):24-29.3 马常耕.世界林木树种抗逆性育种研究进展J.世界林业研究,1995:4-12.4 汤章城.植物对水分胁迫的反应和适应性（2）J.植物生理学通讯，1983（4）：1-7.5 张怡，罗晓芳，沈应柏.土壤逐渐干早过程中刺槐新品种苗木抗氧化系统的动态变化J.浙江林学院学报，2005,22(2):166 一169.6 谢寅峰，沈惠娟.水分胁迫下3种针叶树幼苗抗旱性与硝酸还原酶和超氧化物歧化酶活性的关系J.浙江林学院学报,2000,17(1):24 一 17.7 钱春