3类产品抑菌效力检查方法.doc

标题抑菌效力检查方法文件编号1页数9/81 检查内容及步骤1.1 菌种确认品名标准编号数量（支）菌种代数来源铜绿假单胞菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌黑曲霉确认人及日期： 复核人及日期：1.2 培养基确认品名批号用途来源胰酪胨大豆肉汤培养基胰酪胨大豆琼脂培养基接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌沙氏葡萄糖液体培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基接种白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂培养基黑曲霉确认人及日期： 复核人及日期：6.3培养条件确认6.3.1本检查法中细菌、控制菌的培养温度为 ，真菌的培养温度为 。 6.3.2培养箱确认 序号培养箱名称型号校验日期校验周期校验单位1电热恒温培养箱HH.B11.500-S2生化培养箱LRH-150B确认人及日期： 复核人及日期：6.4样品来源确认品名批号数量来源备注蛋白琥珀酸铁口服溶液确认人及日期： 复核人及日期：6.5操作环境确认为 的洁净区域以内，局部（操作台）为 级并单向流空气。确认人及日期： 复核人及日期：7 培养基的适用性检查7.1抑菌剂效力测定用培养基应进行培养基的适用性检查，包括成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。7.2菌种 试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）CMCC(B)10 104大肠埃希菌 （Escherichia coli） CMCC(B) 44 102金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）CMCC(B)26 003白色念珠菌 （Candida albicans） CMCC(F) 98 001黑曲霉 （Aspergillus niger） CMCC(F) 98 0037.3菌液制备7.3.1接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆肉汤培养基中，3035培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，2025培养2448小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，2025培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50100cfu的孢子悬液。7.3.2菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期内使用。7.3.3菌液浓度确认品名稀释倍数平皿计数结论皿1（cfu/ml）皿2（cfu/ml）平均值（cfu/ml）大肠埃希菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌白色念珠菌黑曲霉7.4适用性检查 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌各50100cfu,分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酪胨大豆琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置3035培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2025培养72小时，计数；同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。7.5结果判定若被检培养基上的菌落平均数不少于对照培养基上菌数平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。检测项菌种名称大肠埃希菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌白色念珠菌黑曲霉试验组菌数对照组菌数被检培养基占对照培养基的菌数比值标准被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上得菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。结论检查人： 复核人：8 抑菌效力检查方法确认8.1菌种：同培养基的适用性检查，若需要，制剂中常见的污染微生物也可作为试验菌株。8.2菌悬液的制备8.2.1铜绿假单胞菌菌悬液：接种铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆肉汤培养基中，3035培养1824小时；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至 ，用比浊法制成每1ml含菌数约为108cfu。8.2.2金黄色葡萄球菌菌悬液：接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆肉汤培养基，3035培养1824小时；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至 ，用比浊法制成每1ml含菌数约为108cfu。8.2.3大肠埃希菌菌悬液：接种大肠埃希菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆肉汤培养基，3035培养1824小时；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至 ，用比浊法制成每1ml含菌数约为108cfu。8.2.4白色念珠菌菌悬液：接种白色念珠菌于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，2025培养2448小时，加入适量的0.9%无菌氯化钠溶液将琼脂表面的培养物洗脱，然后，用适宜方法吸出菌悬液至无菌试管内，取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至 ，用比浊法制成每1ml含菌数约为108cfu。8.2.5黑曲霉菌悬液：操作时关闭空调系统及洁净工作台风机。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，2328培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释至 ，用比浊法制成每1ml含孢子数108cfu的孢子悬液。8.3菌液浓度确认品名稀释倍数平皿计数结论皿1（cfu/ml）皿2（cfu/ml）平均值（cfu/ml）大肠埃希菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌白色念珠菌黑曲霉检查人及日期： 复核人及日期：8.4菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉的孢子悬液可保存在28，在1周内使用。8.5 供试品接种（3类产品）8.5.1抑菌剂效力可能受试验用容器特征的影响，如容器的材质、性状、体积及封口的方式等。因此，只要供试品每个包装容器的装量足够试验用，同时容器便于按无菌操作技术接入试验菌液、混合及取样等，一般应将试验菌直接接种于供试品原包装容器中进行贮存。若因供试品的性状或每个容器装量等因素需将供试品转移至无菌容器时，该容器的材质不得影响供试品的特性（如吸附作用），特别应注意不得影响供试品的PH，PH对抑菌剂的活性影响很大，同时容器的口径大小应便于供试品的进出及混匀。8.5.2取包装完好的供试品5份，取适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中，每一容器接种一种试验菌，蛋白琥珀酸铁为3类供试品，3类供试品中1g或1ml接种菌量为105106cfu，接种菌液的体积不得超过供试品体积的0.5%1%，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。然后将接种的供试品在试验期间置2025，避光贮存，贮存温度的变化应尽可能控制在最小范围，并防止被污染。8.6存活菌数测定8.6.1根据产品类型，在供试品刚接种（0时）及表2规定的间隔时间，分别从上述每个容器中取供试品1ml（g），用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1:10、1:102、1：103等稀释级。采用平皿法（照附录 J微生物限度检查法，其中测定细菌用胰酪胨大豆琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基）测定每份供试品中所含的菌数。8.6.2根据菌数测定结果，计算1ml(g)供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。8.7结果判断8.7.1抑菌剂效力根据各间隔时间的菌数lg值相对于初始值（0时菌数lg值）减少程度进行评价（表2），试验结果按有效数字的修约规则进舍，保留小数点后1位有效数字。结果符合表2要求可判定该产品抑菌效力符合规定。表2 抑菌剂抑菌效力判断标准3类供试品细菌14天菌数下降不少于1.0 lg，14天到28天菌数不增加真菌与初始值比，14、28天菌数均不增加。注：表中“不增加”是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5 lg。：蛋白琥珀酸铁口服溶液（ ）、考察周期（ ）操作人及日期： 名称 级别项目试验菌株大肠埃希菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌白色念珠菌黑曲霉0时计数结果（cfu/ml）平均值（cfu/ml）lg值14天计数结果（cfu/ml）平均值（cfu/ml）lg值判定标准14天菌数下降不少于1.0 lg，与初始值比，14天菌数不增加判定结果28天计数结果（cfu/ml）平均值（cfu/ml）lg值判定标准14天到28天菌数不增加与初始值比，28天菌数不增加判定结果结果报告人及日期： 复核人及日期：蛋白琥珀酸铁口服溶液（ ）、考察周期（ ）操作人及日期： 名称 级别项目试验菌株大肠埃希菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌白色念珠菌黑曲霉0时计数结果（cfu/ml）平均值（cfu/ml）lg值14天计数结果（cfu/ml）平均值（cfu/ml）lg值判定标准14天菌数下降不少于1.0 lg，与初始值比，14天菌数不增加判定结果28天计数结果（cfu/ml）平均值（cfu/ml）lg值判定标准14天到28天菌数不增加与初始值比，28天菌数不增加判定结果结果报告人及日期： 复核人及日期：蛋白琥珀酸铁口服溶液（ ）、考察周期（ ）操作人及日期： 名称 级别项目试验菌株大肠埃希