牛奶中阿维菌素类药物残留检测——高效液相色谱法(SOP)修改版-新.doc

牛奶中阿维菌素类药物残留检测高效液相色谱法1 安全要求该检验的提取、净化步骤应在通风橱中进行，操作中需着工作服、戴口罩手套，避免溶剂气体吸入和皮肤接触；废弃的化学试剂收集到专用容器集中处理。2 急救措施皮肤触到有机溶剂或酸,用清水清洗，溅入眼中用纯水灌洗。3 适用范围该操作规程适用于牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素残留量的制样及测定。4 职责进行该项检验的检验员必须按该操作规程进行检验，质量监督员负责监督该操作规程的正确执行。5 检测原理用乙腈提取试料中残留的阿维菌素类药物，加水稀释，加三乙胺使溶液呈弱碱性，C18固相萃取柱净化，加三氟乙酸酐和N-甲基咪唑衍生化。高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量。6 方法灵敏度本方法在牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的检测限均为1g/kg，定量限均为2g/kg。7 注意事项7.1 整个净化步骤控制C18柱流速约在12 mL/min；7.2 C18柱使用过程中除特别说明外，应避免柱床干涸。 8 材料、仪器、试剂的准备及基本要求除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为超纯水。8.1 阿维菌素标准品 含量95.7%8.2 多拉菌素标准品 含量92.6%8.3 伊维菌素标准品 含量93.9%8.4 乙腈 色谱纯8.5 甲醇 色谱纯8.6 三氟乙酸酐8.7 三乙胺 8.8 异辛烷 8.9 N-甲基咪唑8.10 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相当者8.11 固相萃取柱洗涤液；取乙腈30 mL、水70 mL和三乙胺20 L，混匀。8.12 衍生化试剂a) A液：N-甲基咪唑-乙腈（1+1，v/v）。现用现配。b) B液：三氟乙酸酐-乙腈（1+2，v/v）。现用现配。8.13 1 mg/mL 阿维菌素类药物混合标准贮备液：分别称取阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准品10 mg，精密称定，于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。配制成阿维菌素类药物浓度为1 mg/mL的混合标准贮备液， -20保存，有效期6个月。8.14 10 g/mL 阿维菌素类药物混合标准工作液：准确量取混合标准贮备液0.25 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀释并配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为10 g/mL标准工作液。-20 保存，有效期1个月。8.15 1 g/mL 阿维菌素类药物混合标准工作液：准确量取10 g/mL阿维菌素类药物混合标准工作液2.5 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀释配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为1 g/mL标准工作液。-20 保存，有效期1个月。8.16 高效液相色谱仪（配荧光检测器）8.17 分析天平 感量0.00001 g8.18 天平 感量0.01 g8.19 振荡器8.20 离心机8.21 涡旋混合仪8.22 聚丙烯离心管 50 mL 8.23 氮吹仪 8.24 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相当者8.25 微孔滤膜 0.45 m9 检验步骤9.1 试料的制备9.1.1 取混匀后的供试样品，作为供试试料。9.1.2 取混匀后的空白样品，作为空白试料（阴性对照）。9.1.3 取混匀后的空白样品5 g,添加1 g/mL的工作液0.05 mL，作为空白添加试料。9.2 标准曲线的制备精密量取1 g/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.02、0.05、0.1 mL，于10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度；精密量取10 g/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.25 mL，于50 mL量瓶中，0.1、0.3 mL至10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，配制成浓度分别为2、5、10、50、100、300 ng/mL的阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素混合标准溶液，各取1.0 mL于各自的10 mL试管中，于50 水浴氮气吹干，按衍生化步骤处理后，将系列标准溶液，供高效液相色谱测定，从低浓度到高浓度依次测定，每一浓度进样3针。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。9.3 提取9.2.1 称取(50.05) g试料，于50 mL离心管中，加乙腈8 mL，涡旋混匀，中速振荡5 min，5000 r/min离心10 min。9.2.2 收集上清液于另一50 mL离心管中。残渣再重复提取一次。9.2.3 合并两次上清液，加水15 mL和三乙胺50 l，混匀，备用。9.4 净化9.4.1 依次用乙腈5 mL、固相萃取柱洗涤液5 mL，活化C18固相萃取柱。9.4.2 将备用液过柱，抽干。加异辛烷3 mL洗涤，抽干。9.4.3 用乙腈5 mL洗脱。收集洗脱液于10 mL试管中，50 下用氮气吹干。备用9.5 衍生化向试管中依次加入衍生化试剂A液100 L和衍生化试剂B液150 L，密闭，涡动10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 L，涡动10 s，密闭反应30 min，加650 L甲醇混匀。经0.45 m微孔滤膜过滤，供高效液相色谱检测。9.6 测定9.6.1 色谱条件9.6.1.1 色谱柱：C18柱，（2504.6 mm，粒径5 m）；或相当者；9.6.1.2 流动相：乙腈+水（90+10，v/v）； 9.6.1.3 流速：1.8mL/min；9.6.1.4 检测波长：激发波长： 365 nm，发射波长：475 nm；9.6.1.5 柱温：40 ；9.6.1.6 进样量：20 L。9.7 测定法9.7.1 试样溶液和50 ng/mL的标准溶液，作单点校准，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，试样溶液测定过程中应参插注入标准溶液，以便准确定量。空白、添加、标准溶液高效液相色谱图见附录及附加说明。9.7.2 试剂空白试验除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。9.8 结果计算和表述试料中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的残留量（g/kg），按下式计算： X = 式中: X 试料中相应的阿维菌素类药物的残留量，g/kg；C 试样溶液中相应的阿维菌素类药物的浓度，ng/mL；V 衍生化后试样的总体积，mL；m 供试试料的质量，g。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9.9 结果判定9.9.1 线性范围阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在2300 ng/mL范围考察线性，计算回归方程，其相关系数应0.995。9.9.2 准确度 本方法在250 g/kg添加浓度的回收率为70120 %。9.9.3 精密度本方法的批内相对标准偏差15%，批间相对标准偏差20%。9.9.4 判定当方法学考察结果符合上述规定时，供试组织中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的残留量单个及之和检测限时，判定为未检出；方法检测限最高残留限量时, 判定为符合规定； 最高残留限量时，判定为不符合规定。注：仅当方法检测限时，为参与阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素总残留量求和计算，故求和公式中0n3。9.10 附录及附加说明阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在牛奶中的最高残留限量药物名称标志残留物动物品种组织MRL（g/kg）阿维菌素阿维菌素牛奶不得检出多拉