基因工程总结.doc

基因工程原理一、重组DNA技术基本原理基本原理：目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 外源基因与载体的连接 DNA导入受体菌 重组体的筛选 克隆基因的表达 分、切、接、转、筛以质粒为载体的DNA克隆过程（一）目的基因的获取1. 化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3. cDNA文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)* 化学合成法获取目的基因氨基酸 trp phe met lys ACC AAG TAC TTT ACC AAA TAC TTT可能的DNA序列 ACC AAG TAC TTC ACC AAA TAC TTC由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列* 从基因组DNA文库获取目的基因组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片断 基因组DNA文库：克隆载体 存在于转化细胞内重组DNA分子 由克隆载体所携带的所受体菌 有基因组DNA的集合。含重组分子的转化菌（二）克隆载体的选择和构建1. 载体 （Vectors）在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克 隆载体。表达载体(expression vector) ：为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准- 能自主复制；- 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；- 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；- 分子量小，以容纳较大的外源DNA。（三）外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接2. 平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端，粘端补齐或切平形成的平端3. 同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。4. 人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工街头及其应用（四）重组DNA导入受体菌10受体菌条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent) 导入方式：转化 (transformation)转染 (transfection)感染 (infection)一、感受态大肠杆菌的制备1. 目的：增加受体菌细胞膜的通透性。3. 制备原理用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。原理：将对数生长期的细菌在0下, 用预冷的CaCl2溶液低渗处理, 以使菌体的细胞壁 和细胞膜通透性增加, 菌体膨胀成球形。DNA易于进入细菌的细胞内。感受态细菌:是指细菌处于容易接受外源DNA的状态。 转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一种基因型细胞的DNA, 进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现象。常见转化方法有：原生质体转化法；化学转化法；电穿孔法。感受态细胞的制备过程（1）取-70冻存的DH5a菌种划线接种于不含抗生素的LB琼脂平皿上，37 温箱培养1216h后，挑取生长良好的单个菌落，接种于5mL LB液体培养基中，37250300r/min振荡培养56h。 （2）将适量活化后的菌液无菌转接到装有50mL LB的盐水瓶中，继续振荡培养约2.53h，至OD600nm值达到0.50.6时，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷的50 mL聚丙烯离心管中，冰上放置30min。（3）4 4000 r/min离心10min，弃上清，将离心管倒置1min使残留培养液流尽后，于沉淀中加入10mL冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀，冰浴30min。（4）4 4000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀中加入用冰预冷的0.1mol/L CaCl2约2mL(视细菌量而定)，轻轻重悬菌体，即为制备好的感受态细胞，可直接取少量（约100L）马上用于转化或放冰浴中置4短期存放（一般于3天内用完）。可加入终浓度15%无菌甘油，分装0.1mL/管，-70冰箱保存备用。转化过程- 取制备好的感受态细胞100L（或取-70冻存的感受态细胞于冰上融化后，取100L）于一无菌的1.5mL EP管，加入连接产物（约10L），混匀，冰浴30min后，于42水浴热击90sec，再冰浴25min。加入400L的LB，37200220r/min摇床复苏培养4560min，5000r/min离心3min，弃去400L上清，用余下部分上清轻轻重悬细菌沉淀，并均匀涂布抗性平板，先正放于37温箱中12h，使平板表面液体充分吸入琼脂中后（以培养基表面无液体流动为适宜），再倒放继续培养至1218h，观察转化单菌落的出现。- 若是转化现成质粒，则于42水浴热击90sec，放回冰上2min后，直接取3050L 菌液直接涂布含相应抗生素的LB平板，然后即可于37温箱培养。（五）重组体的筛选筛选方法：1.遗传检测法标志补救（-半乳糖苷酶法）抗药性标志的选择2. 电泳检测法3. PCR检测法4. 菌落杂交筛选法5. 免疫化学检测法6. DNA序列检测b-半乳糖苷酶显色反应选择法(-互补法)乳糖 半乳糖 + 葡萄糖 b-半乳糖苷酶 Xgal 半乳糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 深蓝色1. 原理：载体上有一段b-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的a片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 可以被IPTG诱导表达。2. 选择过程抗药性标记选择（插入失活法）DNA电泳检测法 利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。1.直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。2.酶切电泳筛选法(1) 原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。PCR筛选法 利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR，通过对PCR产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。原位杂交Southern印迹免疫筛选法DNA序列测定法 小 结重组DNA技术操作过程可形象归纳为 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤载体 目的基因（外源基因）质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因连接酶重组体转化 体外包装，转染带重组体的宿主 筛选表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交（六）克隆基因的表达体外表达：无细胞表达系统 原核表达系统：大肠杆菌表达系统 体内表达： 酵母表达系统 真核表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统 动物/植物表达系统（转基因动物/植物） 外源基因在原核细胞中的表达用原核生物作宿主。原核或噬菌体启动子SD序列MCS终止子 1. E.coli表达体系优势：一种成熟的基因克隆表达的受体细胞 繁殖迅速，培养代谢易于控制 易于进行遗传操作和高效表达不足之处：1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。4）表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 5）很难表达大量可溶性蛋白2.目的基因表达产物的检测1）蛋白质的PAGE2）表达蛋白生物学功能检测：淀粉酶基因表达3.目的蛋白的分离纯化分子筛、亲和柱、离子交换、抗原抗体外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1. 细胞质中表达（1）包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。 优点：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 缺点：回收的蛋白生物活性差。例：在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（human growth hormone, hGH）。2. 周质中表达（1）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。3. 胞外表达使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。几种类型的原核表达载体1. 非融合型表达载体载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。2. 分泌型表达载体载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。3. 融合蛋白表达载体系统-pGEX系列表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。（1）优点：便于融合蛋白的分离和纯化。taclacPlacOS-D/ATGGST插入位点TGA lacI（3）产物提纯GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。（4）产物分离用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。柱（column）GST外源蛋白 凝血酶 柱（column）GST外源蛋白 洗脱 柱（column）GST可再利用 外源基因在真核细胞中的表达酵母菌、植物原生质体、动物培养细胞等。 外源基因真核或病毒启动子MCSPolyA信号终止子1.真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济转染 将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染，DEAE葡聚糖介导转染，电穿孔，脂质体转染，显微注射 磷酸钙沉淀法（左图） 原理：HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。 特点：不需要载体。脂质体（lipofectin）载体法（右图）脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。显微注射法(microinjection)直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。酵母表达系统1基因背景了解清楚，上游操作简单，生长迅速，非常适于大规模发酵。2具有一定的加工及修饰能力：如二硫键的正确形成，前体蛋白的水解加工。表达产物与天然蛋白相同或类似。3可将异源蛋白基因与N-末端前导肽等信号肽融合，指导新生肽的分泌，在分泌中可对表达的蛋白进行糖基化修饰，但其修饰糖链与高等真核细胞并不相同。 4可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题。 缺点：产糖量过多因而损坏蛋白质的生物活性、安全性等；糖基化修饰与高等真核细胞并不相同。 载体：均为大肠杆菌和酵母菌的“穿梭”质粒。酵母表达系统载体有：1整合型载体: 导入酵母宿主细胞后与酵母细胞染色体基因组DNA整合，稳定性高，但基因拷贝数低。 2附加体型载体：在酵母宿主中拷贝数量大，但在传代过程中易丢失，影响重组菌的稳定性和表达量。 常见宿主有：酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母、巴氏毕赤酵母等。 昆虫细胞表达系统 昆虫细胞表达系统是以杆状病毒为载体，昆虫细胞为宿主的表达系统。 1表达效率高。重组蛋白的表达水平最高可达到细胞总蛋白的50。2属于真核表达系统。有糖基化作用、脂肪酸酰基化作用、氨基末端乙酰化作用以及磷酸化，有利于表达产物形成天然的高级结构，保持原有的生物活性与功能。3杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖。4杆状病毒属于昆虫病毒。具有高度特异的宿主范围，对脊椎动物和植物均无致病性。病毒重组因失去多角体保护，在自然界的生存能力很弱，因此比较安全。5应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因可表达毒性蛋白。 6杆状病毒表达载体通用性广。可表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白，并且能表达带有内含子的外源基因。 7重组杆状病毒除在体外昆虫培养细胞表达外源基因外，还能感染昆虫活体，在体内高效表达外源蛋白。宿主细胞生长慢、 培养基昂贵、 含有免疫宿主蛋白、 杆状病毒感染会导致宿主死亡、因此每一轮蛋白合成均需重新感染、昆虫细胞内的糖基化方式与脊椎动物细胞内的糖基化方式有一定的差异，其糖蛋白的糖链结构多为简单的不分支结构。 启动子采用多角体蛋白启动子。宿主细胞通常来源于双翅目昆虫，包括果蝇、蚊子。来源于草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）的Sf9细胞系是最常用的宿主细胞。商品化系统： BaculoDirect 杆状病毒表达系统（invitrogen），典型的杆状病毒表达系统是利用大肠杆菌中位点特异的转座或昆虫细胞中的同源重组来产生重组杆状病毒。 DES-Drosophila expression system 结合了昆虫细胞高表达水平和哺乳动物细胞的稳定表达的优点。 哺乳动物细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统是生产天然蛋白的理想表达系统，是目前应用最广泛的动物细胞表达系统。其优点和缺点都极其显著。产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等后加工最精确。一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。但该表达系统的表达水平较低、培养基昂贵、生长缓慢、含有过敏物质等缺点在实际应用过程中较难避免。哺乳动物细胞表达系统通常用来生产用常规方法无法获得的真核细胞蛋白。载体：1病毒性载体系统，包括逆转录病毒载体及其它DNA病毒载体。 优点：能够高效导入外源基因。 缺点：包装时对其基因组的长度有严格的限制，插入外源基因一般较短。2质粒性载体系统。 优点：适用于多种细胞；安全。 缺点：导入外