高效液相色谱指纹图谱法- 标准名称.doc

DB3301杭州市农业标准规范DB 3301/T 1822010蜂胶鉴别法高效液相色谱指纹图谱法2010 - 12 - 30发布2011 - 01 - 30实施杭州市质量技术监督局发布DB3301/T 1822010前言本标准附录A、附录B为规范性附录。本标准由杭州市质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：杭州蜂之语蜂业股份有限公司、国家水产品及加工食品质量监督检验中心、浙江大学动物科学院、桐庐县质量计量监测中心。本标准主要起草人：周萍、钱志明、屠海云、胡福良、陈建清、钱志来、童良明、梁世君。本规范为首次发布。6蜂胶鉴别法高效液相色谱指纹图谱法1 范围本标准规定了高效液相色谱指纹图谱鉴别蜂胶真伪的方法。本标准适用于蜂胶原料、以食用酒精为溶剂提取的精制蜂胶及蜂胶制品中的中国蜂胶真伪鉴别。本标准鉴别方法为定性鉴别方法。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法保健食品检验与评价技术规范（2003版） 保健食品中总黄酮的测定方法3 原理样品经过甲醇提取，用0.4%H3PO4酸化，以流动相定容，以高效液相色谱在360nm波长下测定样液的指纹图谱，根据样品与蜂胶、杨树胶及黄酮类化合物对照品特征色谱峰的相似程度比较，定性鉴别蜂胶真伪。4 试剂4.1 黄酮类化合物对照品4.1.1 芦丁：对照品，纯度92%；4.1.2 槲皮素：对照品，纯度98%。4.2 磷酸分析纯。 4.3 甲醇：色谱纯。4.4 0.4%（V/V）磷酸吸取4 ml磷酸（4.2）到加有900 ml水的容量瓶中，用水定容至1000 ml。4.5 芦丁槲皮素对照液称取芦丁、槲皮素对照品各10 mg（按标准物质证书上标示的浓度折算后得到），用甲醇溶解并定容到100 ml，此对照液中芦丁、槲皮素的浓度为100 g/ml。4.6 水实验用水应符合GB/T 6682中一级水标准。4.7 蜂胶质控样品制备方法见附录B。4.8 杨树胶质控样品制备方法见附录B。5 仪器和设备5.1 电子天平：感量0.0001 g。5.2 高效液相色谱仪配紫外检测器。5.3 平头进样针：量程10微升。5.4 容量瓶：50 ml，100 ml。5.5 量筒：1000 ml。5.6 移液管：10 ml。5.7 一次性针孔式过滤器。5.8 氮吹仪。5.9 离心管：10 ml。5.10 移液枪：100-1000l。6 测定步骤6.1 样品前处理按照保健食品检验与评价技术规范（2003版）中保健食品中总黄酮的测定方法预检测样品中的总黄酮含量，称取适量样品（精确到0.1mg）使样品中含有约10mg总黄酮，放入50ml容量瓶中，加入9ml甲醇（4.3），充分溶解样品，必要时可以超声波助溶，加入6ml0.4%磷酸(4.4)，混匀溶解后，用流动相定容，摇匀，用定性滤纸过滤，弃去约5ml初滤液，取续滤液约1ml过0.45um滤膜于样品瓶中。同上法处理蜂胶、杨树胶质控样品。6.2 测定6.2.1 色谱条件6.2.1.1 色谱柱：Venusil MP C18 250mm4.6mm5m或相当者；6.2.1.2 流动相：甲醇+0.4%磷酸（V/V）=60+40；6.2.1.3 柱温：35；6.2.1.4 进样量：5l；6.2.1.5 流速：1ml/min；6.2.1.6 检测波长：360nm。6.2.2 指纹图谱测定向高效液相色谱仪注入5l样液，按6.2.1色谱条件检测，收集0至80min的色谱图。6.2.3 芦丁槲皮素标准品色谱图测定 吸取芦丁槲皮素对照品液100l于10ml离心管中，常温下氮气吹干，用1ml流动相溶解，按6.2.2方法测定，收集0-30min的色谱图。6.3 方法精密度在重复性条件下对同一试样连续进行两次测定，选定其中5个特征峰（见附录A），要求保留时间的RSD1.5%，峰面积的RSD5%。7 定性判定在相同试验条件下，将样品指纹图谱与同时检测的蜂胶、杨树树胶质控样品指纹图谱、芦丁槲皮素标准物质色谱图进行比较。同时将指纹图谱分为六个区域，选定其中5个特征峰并编号，以方便比较和结果判定，典型的指纹图谱见附录A。7.1 蜂胶定性鉴别供试样品六个区域的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比均含有，峰强度相似，且1、2、3、5号特征峰的峰面积为蜂胶质控样品的50以上；可判定为“真”。7.2 杨树树胶定性鉴别供试样品六个区域的主要特征色谱峰与杨树树胶质控样品相比均含有，峰强度相似，1号、2号峰强度为蜂胶质控样品的50%以下，并3号和5号峰面积为蜂胶质控样品的30%以下，可判定为“伪”。7.3 蜂胶中掺入杨树树胶定性鉴别供试样品六个区域的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比，均含有，但3、5号特征峰的峰面积为蜂胶质控样品的3050%；且一至三区特征色谱峰与蜂胶质控样品相比，强度较弱；可判定为“掺伪”。7.4 蜂胶中掺入黄酮类化合物定性鉴别供试样品六个区域的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比均含有，但是某个特征峰峰高异常，峰面积超过蜂胶质控样品的2倍以上。可判定为“掺伪”，与芦丁槲皮素标准物质色谱图比较，可以判断添加黄酮类化合物的种类。7.5 非蜂胶物质的定性鉴别供试样品六个区域的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比，不具有大部分蜂胶的主要特征色谱峰。可判定为“伪”。8 结果表述用真、掺伪和伪表示 。AA附录A （规范性附录）典型HPLC指纹图谱典型的指纹分区：一区：08min二区：814.5min三区：14.522min四区：2234min五区：3450min六区：5080min主要5个相同特征峰的保留时间：1号峰：23.78min2号峰：25.66min3号峰：27.92min4号峰：29.70min5号峰：31.61min43521图A.1、典型的蜂胶HPLC指纹图谱21354图A.2、典型的杨树胶HPLC指纹图谱流图21354图A.3、典型的掺入芦丁、槲皮素的蜂胶制品HPLC指纹图注： 由于流动相配制、仪器性能、环境条件的变化，各色谱峰的保留时间可能会有较明显的变化。BB附录B （规范性附录）蜂胶质控样品与杨树胶质控样品的制备方法B.1 蜂胶质控样品的制备方法B.1.1 制备方法取经过感官检验合格的蜂胶粗品10g，经过粉碎机粉碎，置于烧杯中，加入95%食用酒精40g，常温下超声提取30min，过滤，滤液置于150ml茄形瓶中在旋转蒸发器上45减压浓缩至粘稠，转到蒸发皿中，70-90水浴继续蒸去乙醇，至无乙醇味，趁热倒入不锈钢盘中，70，-0.096MPa0.1MPa真空干燥4h，制得蜂胶质控样品。B.1.2 检测取蜂胶质控样按GB/T 24283蜂胶中乙醇提取物含量测定方法检测，要求乙醇提取物含量95%。B.1.3 验证取蜂胶质控样品按本标准方法测定HPLC指纹图谱，应该与附录A中典型的蜂胶HPLC指纹图谱一致。B.2 杨树胶质控样品的制备方法B.2.1 制备方法取市售杨树胶粗品10g，经过粉碎机粉碎，置于烧杯中，加入95%食用酒精40g，常温下超声提取30min，过滤，滤液置于150ml茄形瓶中在旋转蒸发器上45减压浓缩至粘稠，转到蒸发皿中，70-90水浴继续蒸去乙醇，至无乙醇味，