分子生物学 总结讲义.docx

分子生物学串讲绪 论 现代分子生物学是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的一门新兴学科，是生物学的一个分支。它以核酸和蛋白质等生物大分子为对象，研究其结构及在遗传信息和代谢信息传递中的作用，是当前生命科学中发展最快、并与其它学科有着广泛交叉与渗透的前沿科学。分子生物学的发展为人类认识生命带来了新的机会，也为人类利用和改造世界创造了广阔的前景。现代分子生物学的发展大致可分为三个阶段：第一阶段是准备和酝酿阶段：19世纪后期到20世纪50年代初，是现代分子生物学诞生的准备和酝酿的阶段。在这个阶段中产生了两点对生命本质认识的重大突破，即确定了蛋白质是生命的主要基础物质和确定了生物遗传的物质基础是DNA。第二阶段是现代分子生物学的建立和发展阶段：从50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑，开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。DNA双螺旋结构发现的最深刻意义在于：确立了核酸作为信息分子的结构基础，提出了碱基配对是核酸复制、遗传信息传递的基本方式，从而最后确定了核酸是遗传的物质基础，为认识核酸与蛋白质的关系及其在生命中的作用打下了最重要的基础。在研究DNA复制和将遗传信息传给子代的同时，科学家们还提出了RNA在遗传信息翻译成蛋白质的过程中起着中介作用的假说。上述重要的发现共同建立了以中心法则为基础的分子遗传学基本理论体系。所谓分子遗传学的中心法则是指在1953年由克里克(Crick)提出的遗传信息传递的规律，包括由DNA到DNA的复制、由DNA到RNA的转录和由RNA到蛋白质的翻译等过程。20世纪70年代逆转录酶的发现，表明还有由RNA逆转录形成DNA的机制，此发现是对中心法则的补充和丰富。 第三阶段是初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段：70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期的开始。其间的重大成就包括：重组DNA技术的建立和发展、基因组研究的发展、单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展、基因表达调控机理和细胞信号转导机理的研究成为新的前沿领域等。以上简要介绍了现代分子生物学的发展过程，可以看出，在近半个世纪中它是生命科学范围发展最为迅速的一个前沿领域，推动着整个生命科学的发展。第一章 遗传物质的分子结构、性质和功能作为遗传物质的核酸，是最重要的生物大分子，也是遗传的物质基础。核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。大多数生物的遗传物质都是DNA，仅有少数病毒的遗传物质是RNA。通常说，DNA是遗传信息的载体。核酸水解得到的是脱氧核苷酸/核苷酸，再进一步分解为脱氧核苷/核苷和磷酸，脱氧核苷/核苷还可以分解为戊糖和碱基。所以说，核苷酸是构成核酸的基本单位，核苷酸是由碱基、戊糖和磷酸三种物质所组成。核酸的化学组成：核酸（DNA/RNA）核苷酸磷酸核苷戊糖（脱氧核糖/核糖）碱基（嘌呤碱/嘧啶碱）两类核酸的存在部位、功能和基本化学组成见表1-1。表1-1 核酸的存在部位、功能和化学组成核酸DNARNA存在部位主要在细胞核主要在细胞质功能遗传信息的载体遗传信息的表达化学组成戊糖2-脱氧核糖核糖碱基嘌呤腺嘌呤A鸟嘌呤G腺嘌呤A鸟嘌呤G嘧啶胞嘧啶C胸腺嘧啶T胞嘧啶C尿嘧啶U磷酸磷酸磷酸 图1-1 核酸结构图核苷酸在人体内分布广泛，具有多种生物学功能：核苷酸是构成核酸的基本单位，这是其最主要功能；核苷酸能以三磷酸核苷酸的形式储存能量，尤其是ATP是细胞的主要能量形式；另外，一些活化的中间产物，如UDP-葡萄糖，亦含有核苷酸成分；核苷酸还参与代谢和生理调节，许多代谢过程都受到体内ATP、ADP或AMP水平的调节。cAMP(或cGMP)是多种细胞膜激素受体调节作用的第二信使；核苷酸还参与组成辅酶，如腺苷酸可作为NAD、ANDP、FMN、FAD及CoA等的组成成分。第一节 DNA的结构与功能 一、DNA的一级结构腺膘呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)与磷酸、脱氧核糖构成相应的dNMP(脱氧核苷酸：包括dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)，是DNA的结构单位（图1-2）。脱氧核苷酸（dNMP）通过3,5-磷酸二酯键连接，构成单链线性DNA，这是DNA的一级结构，换句话说，DNA的一级结构是指脱氧核苷酸的序列。 图1-2 核苷酸的组成单链线性DNA有两个不同的末端，所以有方向性：一端的5磷酸基是游离的，称为5端，视为头；另一端的3羟基是游离的，称为3端，为尾。DNA的书写方向是从头到尾，即53。由于脱氧核苷酸的排列顺序不同，造成了不同的DNA分子，其长度也可以不一致，所以DNA的一级结构通常定义为DNA中脱氧核苷酸的序列(见图1-3-A)。不同的核苷酸之间只是碱基不同，习惯上称核苷酸序列为碱基序列。简写为5pACTTGAACG 3。AB图1-3-A DNA的一级结构，图1-3-B RNA的一级结构二、DNA的二级结构1953年，Watson和Crick结合Chargaff法则，提出了经典的DNA二级结构模型右手双螺旋模型(见图1-4)。其基本内容是： 图1-4DNA的双螺旋结构模型（1）两股反向平行的DNA链绕成同轴右手双螺旋，双螺旋表面有大沟和小沟。（2）脱氧核糖和磷酸通过3,5-磷酸二酯键相连，构成DNA主链，位于双螺旋的外表面，糖基平面与螺旋轴平行；碱基则位于双螺旋的内部，碱基平面与螺旋轴垂直。（3）两股DNA链由两链间碱基互补形成氢键，即A与T通过两个氢键结合（A=T），G与C通过三个氢键结合（GC），称为碱基互补原则。这样，一股DNA的碱基序列决定了另一股DNA的碱基序列，两股DNA链互相称为互补链。 (4)双螺旋的直径为2nm。相邻碱基的堆砌距离为0.34nm，旋转夹角为36。据此，每一螺旋包括10个碱基对(bp)，螺距为3.4nm。碱基堆积力和氢键维系双螺旋结构的稳定。DNA的双螺旋结构具有多样性，上述Watson和Crick结构模型又称为B型，此外还有A和Z型，见表1-2。表1-2 A、B和Z型DNA的结构特点A型B型Z型螺旋方向右右左每圈bp数111012三、DNA的三级结构DNA双螺旋结构进一步盘曲即形成DNA的高级结构三级结构。（一）闭环双链DNA形成超螺旋真核生物线粒体和某些病毒、细菌等的闭环双链DNA都以超螺旋形式存在。增加双螺旋的绕数形成正超螺旋，减少双螺旋的绕数形成负超螺旋。双股DNA正超螺旋为右手超螺旋，负超螺旋为左手超螺旋(见图1-5)。 图1-5DNA形成超螺旋（二）真核生物细胞核DNA形成染色体真核细胞染色质的基本结构单位是核小体，核小体核心由约200bpDNA围绕组蛋白八聚体（H2A, H2B,H3和H4各两分子）1.75周组成，组蛋白H1结合于连接DNA上。核小体彼此相连成串珠状，进一步形成DNA纤维、螺旋管，最终折叠形成染色质（图1-6），至此DNA总压缩达1 000-10 000倍。染色质包括常染色质和异染色质。在有丝分裂中期，染色质压缩形成染色体（染色质和染色体是DNA在细胞周期不同阶段的存在形式）。 图1-6染色体的组装模式第二节 RNA的结构与功能一、概述体内RNA的种类较多，主要存在于细胞质中，最重要的有三种，根据结构和功能的不同分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA。信使RNA(mRNA)是蛋白质合成的模板，转运RNA(tRNA)在蛋白质合成中运输氨基酸，核糖体RNA(rRNA)是蛋白质合成的场所，所以说，这三种RNA与蛋白质的合成有关。RNA的基本结构与DNA一致，也是由四种基本的核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成的长链，即RNA是单链线性分子。与DNA不同之处是，构成RNA的核苷酸含核糖而不是脱氧核糖，含尿嘧啶(U)而不含胸腺嘧啶(T)。因此，构成RNA的四种核苷酸是AMP、GMP、CMP和UMP（图1-3-B）。二、mRNAmRNA又叫信使RNA，是携带来自DNA的遗传信息并指导蛋白质合成的RNA。mRNA的含量最少，约占RNA总量的2%。mRNA一般都不稳定，代谢活跃，更新迅速，半衰期短。mRNA分子中从5-未端到3-未端每三个相邻的核苷酸组成的三联体代表氨基酸信息，称为密码子。mRNA的生物学功能是传递DNA的遗传信息，指导蛋白质的生物合成。细胞内mRNA的种类很多，分子大小不一，由几百至几千个核苷酸组成。（一）原核生物mRNA的结构特点原核生物mRNA多为多顺反子mRNA，即在一个mRNA上，含两段以上编码序列，分别编码不同的蛋白质多肽链，在编码序列之间有间隔序列，在5端和3端有非翻译区，一般不含修饰核苷酸。（二）真核生物mRNA的结构特点真核基因转录产物为单顺反子，即一个基因编码一条多肽链或RNA链，每个基因转录有各自的调节元件。真核生物mRNA的结构特点如下：1mRNA的5-未端有一个7-甲基鸟嘌呤核苷三磷酸（m7Gppp）的“帽”式结构。此结构在蛋白质的生物合成过程中可促进核蛋白体与mRNA的结合，加速翻译起始速度，并增强mRNA的稳定性，防止mRNA从头水解。2mRNA的3-未端有一段含30200个核苷酸残基组成的多聚腺苷酸（polyA）。此段polyA是转录后逐个添加上去的。原核生物一般无polyA的结构。此结构与mRNA由胞核转位胞质及维持mRNA的结构稳定有关，它的长度决定mRNA的半衰期（图1-7）。 图1-7 真核生物mRNA结构图在细胞核内合成的mRNA初级产物被称为不均一核RNA（hnRNA）,它们在核内迅速被加工、剪接成为成熟的mRNA并透出核膜到细胞质。三、tRNAtRNA又叫转运RNA，是在蛋白质合成过程中负责转运氨基酸的RNA。tRNA约含70-100个核苷酸残基，是分子量最小的RNA，占RNA总量的16%，现已发现有100多种。tRNA的主要生物学功能是转运活化了的氨基酸，参与蛋白质的生物合成。各种tRNA的一级结构互不相同，但它们的二级结构都呈三叶草形。该结构含三个环和四个臂，其中含有3-末端的螺旋区称为氨基酸臂，因为此臂的3-末端都是C-C-A-OH序列，可与氨基酸连接。反密码子环上有由三个碱基组成的反密码子。tRNA在二级结构的基础上进一步折叠成为倒“L”字母形的三级结构（图1-8）。 图1-8 tRNA的二级结构和空间结构核酸的碱基组成除A、T、G、C、U外，还有少量的稀有碱基，这些稀有碱基主要存在于tRNA分子中，即tRNA分子中稀有碱基的数量是所有核酸分子中比例最高的，这些稀有碱基的来源是转录之后经过加工修饰形成的。四、rRNArRNA又叫核糖体RNA，是细胞内含量最丰富的RNA，占总RNA的80%以上。rRNA单独存在时不执行其功能，它与多种蛋白质结合成核糖体，作为蛋白质生物合成的“装配机”。核糖体由大、小两个亚基构成。核糖体亚基和所含rRNA的大小一般用沉降系数S表示（S为大分子物质在超速离心沉降中的一个物理学单位，可间接反应分子量的大小）。rRNA的分子量较大，结构相当复杂。原核生物的rRNA分三类：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA。真核生物的rRNA分四类：5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。以大肠杆菌和小鼠肝为例，各亚基所含rRNA和蛋白质的种类和数目如表1-3。表1-3 核糖体中包含的rRNA和蛋白质来源亚基rRNA种类蛋白质种类数原核生物（大肠杆菌）大亚基（50S）小亚基（30S）5S、23S16S3121真核生物（小鼠肝）大亚基（60S）小亚基（30S）5S、5.8S、28S18S4933除上述三种主要的RNA外，体内还有一些小分子RNA存在，包括核内小RNA（snRNA）、胞质小RNA（scRNA）和核仁小RNA（snoRNA），snRNA参与hnRNA的剪接且具有催化作用。小干扰RNA（siRNA）引发的RNA干扰（RNAi）近来成为研究热点之一。五、核酶核酶是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂。核酶的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。第三节 核酸的变性、复性和杂交核酸是两性电解质，可以被核酸酶水解。核酸在260nm处有最大光吸收，该性质可用于核苷酸、核酸的定量分析。一、DNA的变性DNA的变性是指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂（甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺）等，均可引起核酸分子的变性。加热可以使核酸变性，双链解开，产生增色效应，所谓增色效应是指单链DNA紫外吸收比双链DNA高40%，所以DNA变性会导致其紫外吸收值增加。加热使一半DNA变性时的温度称为熔解温度（或解链温度），以Tm表示。DNA中的GC含量越高，Tm值越大。核酸分子越长，Tm值越大。二、DNA的复性热变性的DNA缓慢冷却时，两条解开的DNA链可以恢复双螺旋结构，这一过程叫做复性，又称退火。三、分子杂交利用不同来源的DNA进行退火，如果它们含有互补序列，就可以形成杂化的双链，即形成分子杂交（图1-9）。 图1-9 分子杂交杂交可以发生于DNA与DNA之间，也可以发生于RNA与RNA之间和DNA与RNA之间。常用核酸分子杂交技术包括有印迹杂交和原位杂交两种。印迹杂交包括DNA印迹法和RNA印迹法等。其中DNA印迹法（Southern blotting）分析的待测核酸是DNA，RNA印迹法(Northern blotting)分析的待测核酸是RNA, 原位杂交法检测的可以是DNA，也可以是RNA。值得注意的是还有一种叫 Western blotting的方法，它是一种检测蛋白质的方法，请注意不要彼此混淆。在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称探针技术。一小段(例如数个至数百个)核苷酸聚合体的单链，有放射性同位素如32P、35S或生物素标记其末端或全链，就可作为探针。把待测DNA变性，与探针共同培育一段时间，使发生杂交。带有放射性的探针若能与待测DNA结合成杂化双链，则说明被测DNA与探针有同源性，即二者的碱基序列是可以互补的，这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但可以对有症状的患者进行确诊，还可以发现一些没有症状的隐性遗传性疾病。由于探针技术比较灵敏，可使遗传性疾病的产前诊断变的较为容易了。杂交和探针技术是许多分子生物学技术的基础，在生物学和医学的研究中，以及临床诊断中得到了日益广泛的应用。 第四节 反义核酸及药物所谓反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。它包括反义RNA、反义DNA和核酶三大技术。反义技术是应用碱基配对的原理，以体内表达某种特定蛋白质的靶基因为基础，人工设计一段与之互补的基因片段封闭该靶基因，直接阻断该蛋白质的产生。针对有害基因、突变基因、非正常基因及其过度表达的基因，科学家们设计了反义核酸，使这些基因关闭或者低表达。反义核酸是用人工合成的DNA片段（简称寡核苷酸）与待封闭基因的某一区段互补，能够抑制或封闭靶细胞基因的表达。由于它与基因序列（称为正义链）碱基互补，或者说具有某种意义上的“镜象”关系，因此，这类寡核苷酸称为“反义核酸”。 自1978年反义核酸概念提出到1998年10月第一个反义核酸药物在美国的问世，标志着反义核酸理论已趋于成熟。近年来，国际著名的大型制药公司纷纷以各种方式介入反义技术研究，并且有多个反义核酸药物进入三期临床试验，这些都表明反义核酸技术及其产品的发展前景十分广阔。反义核酸技术在药物研究方面的发展日臻成熟，随着基因组学的发展，在其他方面的应用也开始受到关注。包括农业育种、功能基因研究、化妆品等方面都已经有了成功应用的例子。反义核酸化妆品是在生物技术药物研究的基础上最新发展起来的，与传统化妆品相比，具有高效、高选择性、安全环保等特点。反义核酸技术在化妆品领域的异军突起，代表了化妆品发展的一个重要方向。第五节 RNAiRNAi 又称RNA干扰，是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默（图1-10）。图1-10 RNAi示意图RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解。对果蝇的研究证明，长度为2123nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干扰RNA （siRNA）。在RNA干扰中,一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer酶。它可与双链RNA结合，并将其剪切成2123nt及3端突出的小分子RNA片断，即siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成RNA诱导沉默复合体（RISC），解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解（图1-11）。图1-11 RNA干扰现象的机理RNAi 是一种高效的且特异性强的基因阻断技术，近年来发展迅速，很快就成为功能基因组研究的有力工具。在研究中发现，应用RNAi 技术成功地阻断了MCF7 乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp21 的功能。目前认为，应用RNAi 技术来抑制基因的异常表达，为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。第六节 病毒核酸病毒是一种具有细胞感染性的亚显微粒子，它实际上就是由一个保护性的外壳包裹的一段DNA或者RNA。病毒由两到三个成份组成：病毒都含有遗传物质（RNA或DNA）；所有的病毒也都有由蛋白质形成的衣壳，用来包裹和保护其中的遗传物质；此外，部分病毒在到达细胞表面时能够形成脂质的包膜环绕在外。病毒的形态各异，从简单的螺旋形和正十二面体形到复合型结构。病毒颗粒大约是细菌大小的百分之一。一个完整的病毒颗粒被称为“病毒体”，是由蛋白质组成的具有保护功能的“衣壳”和被衣壳包被的核酸组成（图1-12）。图1-12 病毒的结构 A.无包膜病毒；B.具包膜病毒。衣壳 核酸 壳粒 核衣壳 病毒体 外套膜 刺突蛋白与一般的细胞生物的遗传物质为双链DNA不同的是，病毒的遗传物质（即病毒基因组）可以为DNA或RNA，可以为单链或双链。从目前已发现的病毒来看，更多的是RNA病毒。 病毒的核酸可以是单链或双链，其核酸为RNA或单链DNA的病毒，其核酸链可以被分为正义链或反义链，这种划分取决于其与病毒mRNA是否互补。正义病毒RNA与病毒mRNA等同，因此可以被宿主细胞直接用于翻译。反义病毒RNA与病毒mRNA互补，必须通过RNA聚合酶合成正义病毒RNA后，才能够进行翻译。单链DNA的情况与RNA相似，“编码链”（与病毒mRNA互补）为反义链()，而“非编码链”为正义链(+)。第二章 染色质、染色体、基因和基因组第一节 染色质和染色体一、染色体的发现早在1883年，鲁克斯（WRoux）就观察到细胞核内能被染色的丝状体。1888年，德国人沃尔德耶（WWaldeyer）称这种丝状体为“染色体”，意即可染色的小体，并猜测染色体与遗传有关。1902年，博韦里（TBoveri）和萨顿（WSSutton）指出，染色体在细胞分裂中的行为与孟德尔的遗传因子平行，两者在体细胞中都成对存在，而在生殖细胞中则是成单的存在；成对的染色体或遗传因子在细胞减数分裂时彼此分离，进入不同的子细胞中，不同对的染色体或遗传因子可以自由组合。因而，博韦里和萨顿认为，染色体很可能是遗传因子的载体。二、染色体的结构核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）各两个分子构成的扁球状8聚体。现在我们知道，DNA分子具有典型的双螺旋结构，一个DNA分子就像是一条长长的双螺旋的飘带。DNA双螺旋依次在每个组蛋白8聚体分子的表面盘绕约1.75圈，其长度相当于140个碱基对（核心颗粒）。组蛋白8聚体与其表面上盘绕的DNA分子共同构成核小体。在相邻的两个核小体之间，有长约5060个碱基对的DNA连接线。在相邻的连接线之间结合着一个第5种组蛋白（H1）的分子。密集成串的核小体形成了核质中的100埃左右的纤维，这就是染色体的“一级结构”。在这里，DNA分子大约被压缩了7倍。染色体的一级结构经螺旋化形成中空的线状体，称为螺线体或核丝，这是染色体的“二级结构”。螺丝体的每一周螺旋包括6个核小体，因此DNA的长度在这个等级上又被再压缩了6倍。螺线体（二级结构）再进一步螺旋化，形成直径为0.4微米（m）的筒状体，称为超螺旋体。这就是染色体的“三级结构”。到这里，DNA又再被压缩了40倍。超螺旋体进一步折叠盘绕后，形成染色单体，即染色体的“四级结构”。两条染色单体组成一条染色体。到这里，DNA的长度又再被压缩了5倍。从染色体的一级结构到四级结构，DNA分子一共被压缩了76405=8400倍。例如，人的染色体中DNA分子伸展开来的长度平均约为几个厘米，而染色体被压缩到只有几个微米长。 图1-6染色体的组装模式染色体的超微结构显示：染色体是由直径仅100埃（）的DNA-组蛋白高度螺旋化的纤维所组成。每一条染色单体可看作一条双螺旋的DNA分子。有丝分裂间期时，DNA解螺旋而形成无限伸展的细丝，此时不易为染料所着色，光镜下呈无定形物质，称之为染色质。有丝分裂时，DNA高度螺旋化而呈现特定的形态，此时易为碱性染料着色，称之为染色体。1970年后陆续问世的各种显带技术对染色体的识别作出了很大的贡献。中期染色体经过DNA变性、胰酶消化或荧光染色等处理，可出现沿纵轴排列的明暗相间的带纹（图2-1）。图2-1 电子显微镜下的人类染色体。三、染色体的形态染色体的形态以中期时最为典型。每条染色体由两条染色单体组成，中间狭窄处称为着丝点，又称主缢痕，它将染色体分为短臂（p）和长臂（q）。按照染色体上特征性的标志可将每一个臂从内到外分为若干区，每个区又可分为若干条带，每条带又再分为若干个亚带，例如“9q34.1”即表示9号染色体长臂第3区第4条带的第1个亚带。由于每条染色体带纹的数目和宽度是相对恒定的，根据带型的不同可识别每条染色体及其片段。染色体臂的末端存在着一种叫做端粒的结构，它有保持染色体完整性的功能（图2-2）。图2-2 染色体结构图同一物种内每条染色体所带的DNA的量是一定的，但不同染色体或不同物种之间变化很大，从上百万到几亿个核苷酸不等。由于细胞内的DNA主要在染色体上，所以说遗传物质的主要载体是染色体。第二节 基因基因是细胞内遗传物质的功能单位，主要存在于染色体上，并通过生殖细胞从亲代向子代世代相传。基因的本质是DNA序列，表达一定的功能产物，包括蛋白质和RNA。一个基因除了含有功能产物的编码序列外，还含有表达该编码序列所需的调控序列等非编码序列。一、基因的化学本质1944年，艾佛里（Avery）等首先通过实验证明了DNA是生命的遗传物质。1953年，Watson和Crick在前人工作的基础上，提出了著名的右手双螺旋结构模型。这个模型显示DNA具有自我复制功能。由此人们认识到基因是DNA片段，它决定细胞内RNA和蛋白质的合成，从而决定生物的遗传性状。在20世纪70年代之前，人们一直认为基因的编码序列是连续的。1977年，有研究发现真核生物基因由外显子和内含子交替构成，即其编码序列是不连续的，所以称为断裂基因。断裂基因对分子生物学的基础研究，对癌症和其他疾病的医学研究，有着十分重要的意义。二、基因的基本结构前面我们已经介绍了基因由编码序列和非编码序列构成，真核生物基因的编码序列被一些称为内含子的非编码序列分割成外显子片段。为了方便后面的学习，这里我们以图解的形式介绍与基因结构有关的一组术语。不过它们的严格意义要在学习过相关内容之后才可能得到深刻理解，这里只是简单介绍其相互关系，特别是在DNA序列中的位置关系(见图2-3)。图2-3基因结构编码序列：通常是指直接编码成熟RNA核苷酸序列或蛋白质多肽链氨基酸序列的基因序列。非编码序列：是基因中除了编码序列以外的所有序列。外显子：是真核生物基因经过转录加工后保留于mRNA中的序列和相应的DNA序列。内含子：是真核生物基因被转录不被翻译的、在转录后加工时被切掉的RNA序列和相应的DNA序列。启动子：是在DNA指导合成RNA时，RNA聚合酶首先结合的位点，多数位于基因转录区的上游，属于调控序列。转录起始位点：是在DNA指导合成RNA时，被转录的第一个碱基。终止子：是转录的终止信号，位于基因转录区的下游。其他一些基因定义：重叠基因是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。复等位基因同一基因座出现多个等位基因。假基因基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。基因家族基因组中存在的许多来源于同一个祖先、结构和功能相似的一组基因。同一家族的这些基因的外显子具有相关性，可在基因组内集中或分散分布。三、基因的某些特征原核与真核生物基因结构都包括编码区和非编码区。但是原核生物的编码区是连续的，全部都可以转录出mRNA，编码出蛋白质。而真核基因的编码区是不连续的，又分为外显子和内含子，外显子能够转录出mRNA，编码出蛋白质，而内含子则不可以。因此真核基因的非编码序列包括非编码区的所有序列以及编码区里面的内含子。另外它们的非编码区虽然不能转录出mRNA，但是对基因的转录有调控作用，最重要的一个就是位于基因首端非编码区的启动子和尾端非编码区的终止子，分别起到驱动和终止转录的作用。第三节 基因组生物体细胞内的一套完整的染色单体，叫做染色体组。一个染色体组中所含的全部DNA称为一个基因组。在病毒中通常是一个核酸分子的碱基序列，单细胞原核生物是它仅有的一条染色体的碱基序列，而多细胞真核生物是一个单倍体细胞内所有的染色体（如人单倍体细胞的23条染色体的碱基序列）。多细胞真核生物起源于同一个受精卵，其每个体细胞的基因组都是相同的。 每一种生物都有自己的基因组。不同生物的基因组在结构和组织形式上有很大差别，所携带的遗传信息量也有很大差别。基因组决定了一种生物的全部遗传性状。一、病毒基因组的结构特征病毒(包括噬菌体)是一种较为简单的生命形式。与原核生物或真核生物相比，病毒的基因组很小，并具有以下基本特征：1、所含核酸的种类和结构不同：可能是DNA或RNA、单链或双链分子、闭环或线性结构。2、所含核酸的分子数不同：DNA病毒的基因组都是单一DNA分子。多数RNA病毒的基因组是单一RNA分子；有些则含有多个不同的RNA分子。 3、基因组的大小差异较大：RNA病毒的基因组小，而DNA病毒的基因组大小差异较大。4、基因组为单倍体且含单拷贝基因（逆转录病毒除外）。5、基因组序列基本都是编码序列(90%)，非编码序列很少。6、基因的连续性不同：有连续的，也有不连续的。7、相关基因丛集成一个功能单位或转录单位，协同表达。8、有些病毒基因组存在基因重叠现象。9、有些基因组含有不规则结构基因：如编码序列无间隔或没有翻译起始位点等。二、原核生物基因组的结构特征原核生物的生命活动不只是简单地复制基因组，还存在独立的代谢活动，并且可以根据环境的变化，调控自身代谢。原核生物基因组有如下结构特征：1、基因组通常由单一闭环双链DNA分子组成。2、基因组DNA只有一个复制起点。3、基因组所含基因数量较多，可以形成操纵子结构。4、基因组编码序列一般不重叠。5、基因是连续的，无内含子，因而转录后不需要剪接。6、编码序列约占基因组的50%，高于真核生物低于病毒基因组。7、非编码序列主要是一些调控序列。8、多拷贝基因很少，编码蛋白质的基因大都只有一个拷贝。9、基因组中存在称为转座子的可移动序列。10、在DNA分子中存在各种特异序列，包括复制起点、复制终止区、转录的启动子和终止子等。它们多含回文序列。三、真核生物基因组的结构特征真核生物基因组比原核生物基因组大，结构和功能更复杂，真核生物基因组有如下结构特征：1、真核生物基因组DNA是线性分子，其末端为端粒结构。2、真核生物基因组DNA有多个复制起点。3、真核生物有完整的细胞核，核DNA与组蛋白、非组蛋白及RNA形成染色体结构。4、每一种真核生物的染色体数目都是一定的，精子和卵子为单倍体，体细胞是二倍体。5、真核生物基因组的90%以上是非编码序列。非编码序列和编码序列的比例是真核生物和原核生物、病毒基因组的重要区别，而且在一定程度上是生物进化的标尺。6、真核生物基因组含大量重复序列，包括高度重复序列（重复次数大于106）和中度重复序列（重复次数可达105）7、真核生物基因是断裂基因，由外显子和内含子交替组成。8、真核生物基因的转录产物是单顺反子mRNA。9、真核生物基因组中存在各种基因家族（碱基序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因），基因家族成员可以串联在一起，也可以相距很远。10、真核生物DNA也存在转座子。第三章 可移动的遗传因子（转座子）和染色体外遗传因子第一节 转座一、转座的定义、分类和结构特征（一）定义DNA的转座或称移位，是由可转位因子介导的遗传物质重排现象。也就是说，细胞中能改变自身位置的一段脱氧核糖核酸（DNA）序列。转座依赖于DNA的复制，常被用于构建新的突变体。 转座子（Tn）是存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。（二）分类和结构特征转座子分为两大类：插入序列和复合型转座子。1、插入序列（IS因子）：是最简单的转座子，它不含有任何宿主基因。它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个IS序列。转座子常常被定位到特定基因中，造成该基因的突变。转座时往往复制宿主靶位点一小段（4-15bp）DNA，形成位于IS序列两端的正向重复区。图3-1 DNA转座的一般模式 2、复合型转座子：是一类带有某些抗药性基因(或其他宿主基因)的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子(图3-2)。一旦形成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。大部分情况下，这些转座子的转座能力是由IS序列决定和调节的。 图3-2 复合转座子的两端往往各有一个IS序列，在每个IS序列两侧各有倒置重复序列。（三）原核细胞和真核细胞转座子原核细胞转座子：其原型是E.coli的插入序列 (IS)，一个细菌细胞常带少于10个IS序列。IS两端存在着反向重复序列（IR），IR长短不一。IS本身没有任何表型效应，只携带和它转座作用有关的基因，称转座酶基因。 真核细胞转座子：真核细胞中转座子以玉米和果蝇的研究为最多。玉米中至少有4种影响突变和基因重组的转座子；果蝇中有多个在基因组内随机分布而能重复移动的转座子。在其他高等生物基因组中都存在与玉米或果蝇转座子相似的序列。真核细胞基因组的流动性可能比原核细胞更大。（四）逆转录病毒和逆转录转座子 对于逆转录病毒和逆转录转座子而言，以RNA介导的转座子与逆转录病毒有关，被转移的因子称为逆转录转座子。逆转录转座子是真核生物转座子的重要类型。二、转座机制转座时发生的插入作用有一个普遍的特征，那就是受体分子中有一段很短的（3-12bp）被称为靶序列的DNA会被复制，使插入的转座子位于两个重复靶序列之间。不同转座子的靶序列长度不同，但对于一个特定的转座子来说，它所复制的靶序列长度都是一样的（图3-3）。研究发现，靶序列的复制可能起源于特定内切酶所造成的DNA黏性末端。 图3-3 靶位点直接重复序列的形成转座可被分为复制型和非复制型两大类。在复制型转座中，整个转座子被复制了，所移动和转位的仅仅是原转座子的拷贝。转座酶和解离酶分别作用于原始转座子和复制转座子。与此相对应，在非复制型转座中，原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位。三、转座效应DNA转座的遗传学效应主要有以下几方面： 1、转座引起插入突变：如果插入位于某操纵子的前半部分，就可能造成极性突变，导致该操纵子后半部分结构基因表达失活。 2、转座产生新的基因：如果转座子上带有抗药性基因，它一方面造成靶DNA序列上的插入突变，同时也使这个位点产生抗药性。 3、转座产生的染色体畸变：当复制性转座发生在宿主DNA原有位点附近时，往往导致转座子两个拷贝之间的同源重组，引起DNA缺失或倒位。若同源重组发生在两个正向重复转座区之间，就会导致宿主染色体DNA缺失。 由于转座因子既能给基因组带来新的遗传物质，在某些情况中又能像一个开关那样启动或关闭某些基因，并常使基因组发生缺失、重复或倒位等DNA重排，所以它与生物演化有密切的关系，并可能与个体发育、细胞分化有关。 此外，带有不同抗药性基因的转座因子在细菌质粒间的转座会导致多价抗药性质粒的形成，这将使多种药物药效降低，对人类的健康是一个威胁，因此需要研究解决的办法。另一方面具有独特功能的转座因子已经成为遗传学研究中一种有用的工具。第二节 质粒质粒是游离于细菌染色体之外的遗传物质，是一种共价闭环双链DNA。质粒能携带外源基因进入细菌，并进行扩增或表达。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含有抗生素抗性基因，是重组DNA技术中广泛应用的基因载体。质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。该名词由J.莱德伯格在1952年提出的，但现在习惯上已用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的单纯的DNA分子。某些既能独立地存在于细胞质中又能整合到染色体上的质粒称为附加体。实验证明，同一个大肠杆菌细胞里一般不会同时存在有两种不同的质粒，这是质粒的不相容性。在细菌细胞增殖过程中，其中必有一种会被逐渐排斥。这样的两种质粒被称为不相容质粒。带有外源DNA的质粒载体转化到大肠杆菌细胞以后，会产生一系列生理效应，影响自身的稳定性。特别是表达型的质粒载体，外源基因的表达会使宿主细胞的生长速率下降以及质粒载体的丢失等。这种质粒的不稳定性包括分离不稳定性和结构不稳定性，前者指细菌细胞分裂过程中，有一个子细胞没有得到质粒拷贝，最终使质粒丢失的细胞成为优势群体；后者主要是指由于转座和重组，使质粒DNA重排或缺失。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松驰控制型。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子，如F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20 个以上，如 Col E1质粒。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时, 它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒中的一种，这就是前面提到的质粒的不相容性。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因，其表型包括对抗生素的抗性，产生某些抗生素，降解复杂有机物，产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。质粒作为载体必须具备的4个基本特性：具有复制起点、携带易于筛选的选择标记、具有多种限制性内切酶的切割位点、具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。第三节 基因重组基因重组是指一个基因的DNA序列是由两个或两个以上的亲本DNA组合起来的。基因重组是遗传的基本现象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重组现象。减数分裂或体细胞有丝分裂均有可能发生基因重组。基因重组的特点是DNA双链间进行交换。在真核生物中，重组发生在减数分裂期同源染色体的非姊妹染色单体间，细菌可发生在转化或转导过程中，通常称这类重组为同源重组，即只要两条DNA序列相同或接近，重组可在此序列的任何一点发生。然而在原核生物中，有时基因重组依赖于小范围的同源序列的联会，重组只限于该小范围内，只涉及特定位点的同源区，把这类重组称作位点专一性重组。此外还有一种重组方式，完全不依赖于序列间的同源性，使一段DNA序列插入另一段中，在形成重组分子时依赖于DNA复制完成重组，此类重组称为异常重组，也称复制性重组。转基因是指一种生物体内的基因转移到另一种生物或同种生物的不同品种中的过程。一般来说转基因是通过有性生殖过程来实现的。人们常说的“遗传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转基因的同义词。人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的。基因敲除是指将细胞基因组中某些基因去除或使基因失去活性的技术。如：去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。广义的基因敲除包括某个或某些基因的完全敲除、部分敲除、基因调控序列的敲除以及成段基因组序列的敲除。常用同源重组的方法。敲除的基因用以观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。基因打靶是指通过DNA分子同源重组，特异性改变基因组中靶基因序列，以研究目标基因的体内功能或相关疾病发病机制的一种基因操作技术。第四章 DNA的复制、突变和修复第一节 DNA复制以亲代DNA为模板，合成碱基序列与其完全相同的子代DNA分子，从而将遗传信息准确地传递给子代DNA分子，这一过程称为DNA的复制。现已阐明，在所有生物体中，DNA复制的基本特征是相同的。无论是原核生物还是真核生物，其DNA的复制过程都需要以下物质的参加：DNA模板、dNTP原料、DNA聚合酶、引物和Mg2+。DNA聚合酶催化dNTP的dNMP通过3,5-磷酸二酯键连接到DNA或引物的3羟基上，合成方向为53。一、染色体DNA复制的一般特征1、半保留复制：当DNA进行复制时，亲代DNA分子的两股链必须分开，分别作为模板，按照碱基互补原则指导合成一股新的互补链，结果产生两个子代DNA分子。每个子代DNA分子都含一股亲代DNA链和一股新生DNA链（图4-1）。值得注意的是：复制产物与模板方向相反，如模板DNA为5-AGCTG-3，且根据碱基互补原则，复制产物为3-TCGAC-5）。 图4-1半保留复制2、复制起点和复制子：复制起点是指DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列。细菌、质粒、病毒和酵母通常具有比较明显的复制起点。复制子是一个独立的DNA复制单位，包括复制起点和终点在内的整个复制区域。细菌仅有一个复制子，而真核生物则有多个。3、复制方向：由一个复制起点形成移动方向相反的两个复制叉，为双向复制，这种方式最为普遍。个别环形DNA利用一个复制叉单向复制。无论是单向复制还是双向复制，复制方向都是53（图4-2）。图4-2复制起点和复制方向4、复制叉：双螺旋DNA复制时，在DNA复制生长点一般形成呈叉形（或Y形）的结构，称之为复制叉。在复制叉，至少有20多种的酶和蛋白质因子参与复制，形成复制体。5、半不连续复制：在一个复制叉上进行的DNA合成是半不连续的。其中一股新生链的合成方向与其模板链的解链方向一致，所以解链与合成可以同时进行，合成是连续的，这股新生链称为前导链；而另一股新生链的合成方向与其模板链的解链方向相反，只能先解开一段模板链，再合成一段新生链，合成是不连续的，这股新生链称为后随链。分段合成的后随链片段称为冈崎片段（Okazaki片段）(见图4-3)。图4-3 复制叉和半不连续复制6、引物：所有DNA聚合酶均不能从游离的核苷酸开始合成DNA链，必须利用引物提供自由的3-OH末端，通过加入核苷酸使DNA链得以延伸。引物的主要形式是RNA，少量的病毒（噬菌体）以DNA或者核苷酸（结合蛋白质）为引物。合成引物的是一种性质独特的RNA聚合酶，其催化的反应是以解开的DNA单链为模板，以NTP为原料，按碱基A=U,GC配对原则，催化合成一小段RNA，作为DNA合成的引物。引物的3-OH端是DNA合成的起始点。7、参与DNA复制的酶：参与DNA复制的酶是DNA聚合酶（见表4-