人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及体外转染的生物学活性测定.pdf

第18卷 第3期 医 学 研 究 生 学 报 Vol 18 No 3 2005年3月 Journal ofMedical Postgraduates Mar 2005 论 著 人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及 体外转染的生物学活性测定 鲁雄兵 周四维 杨为民 宋晓东 罗 刚 孙 凯 曹正国 华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科 湖北武汉430030 摘要 目的 构建人淋巴细胞趋化因子 HLptn 真核表达质粒 在膀胱肿瘤细胞株B I U287中表达重组质粒 并检 测趋化活性 方法 用RT2PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增HLptn含编码区序列的cDNA 克隆至pG M2T Easy T载体 测序正确后 将目的片段插入pcDNA3 1 载体 获得阳性克隆pcDNA3 1 2HLptn 用脂质体介 导其转染B I U287细胞 用Western2blot检测转染后细胞中HLptn的表达 取转染后的上清液 采用Boyden小室法检 测表达的HLptn趋化CD4 CD8 T淋巴细胞的生物学活性 结果 克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的 序列编码区内第225位碱基不同 系同义突变 构建了真核重组表达载体pcDNA3 1 2HLptn 转染的B I U287细 胞表达HLptn 其培养上清对CD4 CD8 T淋巴细胞具有趋化活性 结论 成功构建的HLptn真核表达系统可 在人膀胱肿瘤细胞株B I U287中表达 关键词 淋巴细胞趋化因子 克隆 真核表达 中图分类号 Q782 文献标识码 A 文章编号 100828199 2005 03201962043 Construction of human lymphotactin eukaryotic expression vector and detecting of chemotactic activity after being transfectedin vitro LU Xiong2bing ZHOU Si2wei Y ANGWei2min S ONGXiao2dong LUO Gang S UN Kai CAO Zheng2guo Departm ent of U rology Tongji Hospital Tongji M edical College Huazhong University of Science and Technology W uhan430030 Hubei China Abstract O bjective To construct an eukaryotic expression vector containing human lymphotactin HLptn cDNA and to express it in human bladder carcinoma cell BCC line B I U287 and detect chemo2 tactic activity M ethods HLptn cDNA was amplified by RT2PCR from stimulated human peripheral blood mononuclear cells and cloned to vector pG M2T Easy After confirming the sequence the cDNA was inserted into pcDNA3 1 and the postive clone pcDNA3 1 2HLptn was obtained The recombi2 nant plasmid was transfected into B I U287 cellswith Lipofectamine T M 2000 and the expression was detected byWestern blot Its culture supernatantswere used to chemotaxis assay of HLptn attracting CD4 T cells and CD8 T cells with Boyden Chemotaxis Chamber Results The sequence of cloned HLptn cDNA was different from NO U23772 atNo 325 base in ORF itwas same sense mutation Mammalian recom2 binant expression plas mid pcDNA3 1 2HLptn was constructed It can express in B I U287 with Lipo2 691 3收稿日期 2004210221 修订日期 2004211209 基金项目 国家自然科学基金资助项目 批准号 30271300 作者简介 鲁雄兵 19732 男 湖北仙桃人 主治医师 医学博士研究生 从事膀胱肿瘤免疫治疗研究 fectamine T M 2000 Its culture supernatantswas chemotactic for CD4 T cells and CD8 T cells Con2 clusion The eukaryotic expression system of HLptn constructed with ourmethod could express in human BCC cell line B I U287 Key words Lymphotactin Clone Eukaryotic expression 0 引 言 人淋巴细胞趋化因子 human lymphotactin HLptn 是趋化因子 C族的唯一成员 具有趋化 CD4 CD8 T细胞和自然杀伤细胞 natural killer cell NK 等生物学特性 1 淋巴细胞趋化因子 Lptn 在抗肿瘤等方面发挥了重要的作用 2 4 本 实验旨在克隆HLptn cDNA 构建pcDNA3 1 2 HLptn真核表达载体 并用脂质体介导其转染人膀 胱肿瘤细胞系B I U287 检测其趋化CD4 CD8 T 细胞的活性 为研究HLptn基因修饰的膀胱肿瘤疫 苗特异性主动免疫治疗膀胱肿瘤奠定基础 1 材料和方法 1 1 主要试剂及材料 淋巴细胞分离液购自上海 恒信化学试剂公司 密度为 1 077 0 002 g ml RPM I 1640购自Gibco公司 植物血凝素 2M型 PHA2 M 购自Sigma2Aldrich公司 胎牛血清购自杭 州四季青生物工程材料公司 RT2PCR试剂盒Super2 Script One2Step System 含SuperScript RT Taq Platinum DNA Polymerase Mix pG M2T Easy平末端 DNA片段克隆试剂盒购自北京天为时代科技公司 牛小肠碱性磷酸酶 CI AP 限制性内切酶EcoT 14 及EcoR 购自 大连 宝生物工程公司 pcDNA 3 1 LipofectamineT M 2000购自Invitrogen公司 胶回收试剂盒 RNA抽提试剂RNAex Reagent购自 上海华舜生物技术公司 小鼠抗人CD42FITC和小 鼠抗人CD82FITC购自DAKO公司 兔抗HLptn多克 隆抗体购自Peprotech公司 引物合成和质粒测序由 上海申工生物技术公司完成 1 2 细胞株及菌株 人膀胱癌细胞株B I U287由中 国典型培养物保藏中心 CCTCC 保存 TOP10感受 态细胞 含增强剂 购自北京天为时代科技公司 1 3 外周血单核细胞 PBMC 分离和PHA2M刺激 培养 取健康成人抗凝全血5 ml 共4人份 等体积 稀释后加入4 ml淋巴细胞分离液 应用密度梯度离 心法分离PBMC 按约5 10 6悬入含 10 胎牛血清 的RPM I 1640完全培养液10 ml中 加入PHA2M 终浓度为50 g ml 37 5 CO2培养箱培养7 天 1 000 r min离心收获细胞 1 4 HLptn cDNA的克隆 按RNAex Reagent说明 书抽提收获PHA2M刺激培养PBMC的总RNA 一 步法完成HLptn cDNA的逆转录和PCR扩增 上游 引物为5 2GACCTCAGCCATGAGACTTCT23 下游引 物为5 2CTCAGTCCATGAGGGTGTAAA23 用软件 Primer Premier 5 0设计引物 HLptn Genbank登陆 号 U23772 产物预计大小为423 bp PCR仪为 Perkin2Elmer 9600 总反应体系50 l 引物浓度0 3 mol L 反应参数 42 60 min 50 10 min 95 5 min 35次循环 94 45 s 55 45 s 72 60 s 最 后72 延伸10 min 产物行20 g L琼脂糖凝胶电 泳分析 取产物稀释1 000倍作为模板 进行第二次 PCR扩增 产物电泳后行胶回收 依pG M2T Easy平 末端DNA片段克隆试剂盒的操作步骤 将回收的产 物连接到pG M2T Easy T载体 转化TOP10感受态细 菌 铺板倒置 37 恒温培养过夜 应用蓝白斑选择 方法 挑选白色单克隆菌落 于LB培养液中扩增 将菌液送至上海申工公司完成测序 1 5 HLptn真核表达质粒的构建 证实HLptn克 隆至pG M2T Easy载体后 取菌种扩增 扩增含 pcDNA3 1 质粒的菌种 抽提质粒 限制性内 切酶EcoR 酶切重组质粒pG M2T Easy2HLptn和质 粒pcDNA 3 1 20 g L琼脂糖凝胶电泳 切胶 回收HLptn和开环pcDNA 3 1 片段 开环 pcDNA 3 1 片段CI AP去除5 2 末端的磷酸基 20 g L琼脂糖凝胶电泳后再次切胶回收片段 将 两片段按摩尔比约1 1 用T4连接酶连接 产物转 化TOP10感受态细菌 铺板倒置 37 恒温培养过 夜 挑选单克隆菌落6个 扩增 抽提质粒 应用软件 Primer Premier 5 0筛选的限制性内切酶EcoT 14 进行酶切鉴定 筛选正向克隆 即得到构建的HLptn 真核表达质粒pcDNA3 1 2HLptn 由上海申工 公司再次测序 1 6 人膀胱癌细胞株B I U287 HLptn基因修饰及 791 第3期 鲁雄兵 等 人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及体外转染的生物学活性测定 Western2blot检测 用乙醇沉淀法沉淀pcDNA3 1 2HLptn 溶入无菌去离子水 使终浓度约为1 g l 用含10 胎牛血清的RPM I 1640完全培养 液在6孔板中培养B I U287 待细胞生长密度约为 80 时 依Lipofectamine T M 2000的 操 作 手 册 将 pcDNA3 1 2HLptn转染至B I U287细胞 48 h后 收集培养上清行趋化活性检测 收集贴壁细胞 三去 污法提取转染和未转染细胞蛋白 50 g未转染组 25 g和50 g转染组蛋白 12 SDS2 聚丙烯酰氨凝 胶电泳 电转移至硝酸纤维素膜 Western2blot检测 一抗为兔抗HLptn多克隆抗体 1 500稀释 二抗 为HRP标记的羊抗兔IgG 1 2 000稀释 DAB 显色 1 7 HLptn趋化活性的检测 用Boyden趋化小 室法检测HLptn的趋化活性 依前法分离PBMC 应用荧光激活细胞分选器 FACS 分离CD4 CD8 T细胞 所用的抗体为小鼠抗人CD42FITC 和小鼠抗人CD82FITC 分离的CD4 CD8 T细 胞用含10 胎牛血清的RPM I1640完全培养液悬 浮 细胞数约为5 10 6 ml 在Boyden小室内加 入200 l实验组转染细胞培养上清或对照组未转 染细胞培养上清 覆盖直径为13 mm 孔径5 m 的多聚碳酸盐滤膜 小室上部加入200 l分离的 CD4 CD8 T细胞悬液 37 5 CO2恒温箱中 培养2 h 弃小室上部的细胞 用棉签擦净朝上滤 膜的细胞 取下滤膜经75 甲醇固定 干燥后用吉 姆萨液染色 计数5个高倍镜视野的细胞数 按 下式计算趋化指数 趋化指数 实验组移行的细胞数 对照组移行 的细胞数 2 结 果 2 1 HLptn的基因克隆 如图1所示 从活化的 PBMC细胞中扩增的HLptn RT2PCR产物 大小与 预期相当 由于TaqPlatinum DNA聚合酶是一种 高保真酶 其末端无一个突出的A 按pG M2T Easy 平末端DNA片段克隆试剂盒的操作步骤 用Taq DNA聚合酶在其末端加A后 与pG M2T Easy载体 一种T载体 连接 得到重组质粒 测序结果表明 所克隆的HLptn基因序列与U23772所登陆的序 列有一个碱基的差异 其编码区223 225位碱基 为ACA 而U23772编码区223 225位碱基为 ACG 两者同为编码苏氨酸的密码子 第二次测 序再次证实了该结果 图1 HLptn RT2PCR产物电泳分析 Figure 1 Electrophoretic analysis for HLptn RT2PCR products M DNA标记物 1 RT2PCR阴性对照 未加引物 2 RT2PCR阴性对照 未加模板RNA 3 显示RT2PCR扩增 的片段 与预计423 bp大小一致 2 2 含HLptn真核表达质粒的构建 用EcoR 将 连接到pG M2T Easy载体的HLptn片段切下 并克隆 至pcDNA3 1 质粒上 使其受CMV启动子控 制 并用限制性内切酶EcoT14 进行酶切 鉴定阳 性克隆和重组子的方向性 如图2所示 得到正向的 克隆pcDNA3 1 2HLptn 图2 重组质粒EcoT 14 酶切鉴定 Figure 2 Identification of recombinant plas mid withEcoT 14 enzyme digesting M M1 DNA标记物 1 pcDNA3 1 经限制性内切酶 EcoT 14 酶切 片段大小为93 bp 642 bp 1 351 bp 3 342 bp 2 7 挑选的6个克隆 提取质粒后经限制性内切 酶EcoT 14 酶切 2 4 5为正向质粒 片段大小为93 bp 369 bp 642 bp 1 417 bp 3 342 bp 3 6为反向质粒 片段 大小为93 bp 642 bp 746 bp 1 040 bp 3 342 bp 7为空 质粒 2 3 Western2blot检测结果 B I U287细胞系未转染 891 医学研究生学报2005年3月 第18卷 组无HLptn表达 转染组可检测到HLptn的表达 图 3 图3 Western2blot鉴定HLptn Figure 3 HLptn analysis byWestern2blot A B为25 g转染组蛋白 C D为50 g转染组蛋白 2 4 HLptn在B I U287细胞中表达的生物学活性分 析 用pcDNA3 1 2HLptn转染人膀胱肿瘤细胞 系B I U287 应用Boyden小室法检测其培养液上清对 CD4 CD8 T细胞的趋化活性 表1 结果为3次 实验的平均值 表明用Lipofectamine T M 2000介导 pcDNA3 1 2HLptn能在B I U287细胞株中表达 而且其表达的HLptn具有趋化CD4 CD8 T细胞 的生物学活性 表1 培养液上清对CD4 CD8 T细胞的趋化指数 Table 1 Chemotactic index of the culture supernatants from HLptn gene2modified B I U287 on CD4 CD8 T cells 项目实验次数 培养上清稀释度 1 11 5 CD4 33 1 0 22 8 0 3 CD8 33 4 0 32 9 0 2 3 讨 论 趋化因子是一种能趋化和活化白细胞的细胞因 子 在炎症和免疫反应中发挥着重要的作用 现在 发现的趋化因子有C2X32C C2X2C C2C和C共四 族 Lptn是C族的唯一成员 具有趋化CD4 CD8 T细胞和NK细胞等特性 Lptn能在肿瘤免疫治疗 中起作用 Cao等 2 用抗原肽 Mut1刺激Lptn基因 修饰的树突状细胞 能更有效地诱导特异性CTL活 性 使被免疫动物产生更有效的免疫保护作用 抵抗 肿瘤细胞的攻击 Cairns等 3 研究证实 经Lptn基 因修饰的SP2 0骨髓瘤细胞在BALB c小鼠体内能 促进CD4 CD8 T细胞以及中性粒细胞在注射部 位的募集 并在BALB c小鼠体内产生针对SP2 0 肿瘤的特异性免疫反应 在临床上 Rousseau等 4 联合应用转染HLptn基因和人白细胞介素 22 I L2 2 基因的两种神经母细胞瘤疫苗 治疗进展期或难治 性神经母细胞瘤患者 取得了满意的效果 本研究构建了含HLptn全长编码区基因的真核 表达载体 在实验中证实该质粒能在脂质体的介导 下转染B I U287细胞 体外实验培养液上清对CD4 CD8 T细胞具有趋化活性 Cairns等 3 研究证实 在裸鼠体内 Lptn基因修饰的SP2 0骨髓瘤细胞仍 具有致瘤性 但因肿瘤局部有中性粒细胞浸润 所形 成的肿瘤较未经Lptn基因修饰的SP2 0骨髓瘤细 胞形成的肿瘤小 其他研究结果显示 Lptn须与 I L22或I L212联合的转基因治疗才能取得满意的效 果 4 5 这表明Lptn在肿瘤免疫治疗中起到佐剂的 作用 如转染后获得稳定表达HLptn的细胞株在裸 鼠体内致瘤后 利用表达的HLptn对CD4 CD8 T 细胞的趋化活性 趋化经B I U287细胞抗原肽刺激的 树突状细胞活化的T细胞 可进一步探讨HLptn介 导的膀胱肿瘤的免疫治疗 参考文献 1 Hedrick JA Saylor V Figueroa Det al Lymphotactin is pro2 duced byNK cells and attracts both NK cells and T cells in vivo J J I mmunol 1997 158 4 153321540 2 Cao X ZhangW He Let al Lymphotactin gene2modified bone marrow dendritic cells act asmore potent adj