生物工程下游技术参考资料(生物分离工程).doc

生物工程下游技术复习资料一、名词解释1. 凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。 2. 絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。 3. 助滤剂：是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。4. 浸取：也称之为浸出，用某种溶剂把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程。5. 超临界流体（SF）：是指某种气体（液体）或气体（液体）混合物在操作压力和温度均高于临界点时，使其密度接近液体，而其扩散系数和黏度均接近气体，其性质介于气体和液体之间的流体。6. 反胶团：是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发的向内聚集而成，内含微小水滴的空间尺度仅为纳米级的集合型胶体，是一种自我组织和排列而成的，并具有热力学稳定的有序构造。7. 浓差极化：浓差极化是指，当水透过膜并截留盐时，在膜表面会形成一个流速非常低的边界层，边界层中的盐浓度比进水本体溶液盐浓度高，这种盐浓度在膜面增加的现象叫做浓差极化。8. 膜：即死膜，人工合成的无生命的膜，是指分隔两相界面，并以特定形式限制和传递各种化学物质。9. 超滤：以压力差为推动力，以多孔小薄膜为过滤介质，按粒径选择分离溶液中所含的微粒和大分子的膜分离操作。10. 软水：利用钠型阳离子交换树脂去除钙、镁离子后的水。11. 色谱分离：色谱分离也称为色层分离或层析分离，在分析检测中则常称为色谱分析。它是一种物理的分离方法。利用多组分混合物中各组分物理化学性质(如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等)的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中；当多组分混合物随流动相流动时、由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。12. 结晶：当溶质从液相中析出时，形成晶形物质的过程称为“结晶”。13. 干燥：常指借热能使物料中水分(或溶剂)气化，并由惰性气体带走所生成的蒸气的过程。14. 蒸发：使含有不挥发溶质的溶液沸腾汽化并移出蒸汽，而使溶液中溶质浓度提高的过程。蒸发所用设备称为蒸发器。15. 清洁生产：是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以期减少对人类和环境的风险。清洁生产的定义涉及到两个全过程控制：生产全过程控制和产品整个生命周期控制。16. 乳化：是一种液体(分散相)分散在另一种不相混溶的液体(连续相)中的现象。17. 细胞破碎技术：是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。18. 亲和色谱：利用生物物质间的特异性相互作用，或者说是利用了某些生物物质之间特异的亲和力进行选择性分离的一种色谱分离技术。19. 吸藏：是指母液中杂质吸附于晶体表面，如果晶体生长过快，杂质甚至会机械地陷入晶体。20. 表面扩散：是指原子、离子、分子以及原子团在固体表面沿表面方向的运动。当固体表面存在化学势梯度场，扩散物质的浓度变化或样品表面的形貌变化时，就会发生表面扩散。二、选择题1.生物工业下游技术是指（ C）。 A、“物质分离”B、“产品加工”C、“物质分离”和“产品加工”2.在过滤分离中，滤液通过滤饼的速率与其黏度成（B）。 A、正比B、反比C、无关 3.微生物代谢产物大多（ A）。 A、分泌到细胞外B、存在于细胞内三、判断题1.分离是混合的逆过程，是一个熵增加的过程，是一个自发的过程（）。2.发酵液预处理的目的是浓缩目标产物（）。 3.絮凝剂须有长链的线性结构，越长越好（）。 4.细胞壁破碎的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键（）。 5.革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌细胞壁要薄。（）6.离子交换的推动力是离子浓度差。（） 7.离子交换树脂的交联度大，其网孔大，机械强度大。（）四、填空题1以物理学为基础的分离操作，大致可分为以下三类：（平衡分离过程）、（拟平衡分离操作）、（非平衡分离操作）。 2从工程学的角度来说，物性差异（越大），作为分离基础的实际利用价值越大。 3一般地说，物质间的化学作用与物质间的物理作用力相比，选择性（更强），在高度选择性的精密分离中占有重要地位。4（肽聚糖）是细菌细胞壁的主要化学成分；酵母细胞壁的主要成分是（葡聚糖）；霉菌细胞壁主要由多糖组成，其中大多数的多糖壁是由（几丁质）和葡聚糖构成的。 2细胞破碎的目的是释放出细胞内目的产物，方法很多。按其是否使用外加作用力可分为（机械法）和（非机械法）两大类。 5机械法主要有（珠磨法）、（高压匀浆法）、（超声破碎法）和X-press法等。在机械破碎法中，由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，在大多数情况下要采用（冷却）措施，以防止生物产品受热破坏。 6非机械法有（酶溶法）、（化学渗透法）、物理法和干燥法等。 7细胞破碎率测定方法主要有（直接测定法）、（目的产物测定法）和（导电测定法）三种。8按照生成氢键的能力，可将溶剂分成四种类型（N型溶剂）、（A型溶剂）、（B型溶剂）、（AB型溶剂）。 9溶剂萃取的关键是萃取溶剂的选择，而选择的依据是（相似相溶）的原则。 10多级逆流萃取和多级错流萃取相比，萃取剂消耗（少），产物收率(高)。11 制备反胶团系统一般有三种方法：（注入法）、（相转移法）、（溶解法）。12根据膜的形式或排列方式，可以把膜区分为（管式）、（中空纤维式）、（平板式）和（螺旋卷绕式）。 13孔径的测定方法很多，主要有（压汞法）、（泡压法）和（电子显微镜观测法）。 14孔道特征包括（孔径）、（孔径分布）和（孔隙度），是膜的重要性质。15 根据离子交换树脂官能团的性质，将其分为（强酸型）、（弱酸型）、（强碱型）、（弱碱型）、（鳌合型）、（两性）及（氧化还原）等7类。16按照溶质分子与固定相相互作用的机理不同，色谱分离可大致分成以下5大类：（吸附色谱分离）、（分配色谱）、（离子交换色谱）、（凝胶色谱）和（亲和色谱）。 17根据固定相的形状不同，色谱分离技术可分为（柱色谱）、（纸上色谱）、（薄层色谱）。 18根据流动相的物态不同，色谱分离技术可分为（气相色谱分离）、（液相色谱分离）、（超临界色谱分离）。 19根据操作压力不同，色谱分离技术不同可分为（低压色谱分离）、（中压色谱分离）、（高压色谱分离）。 20在色谱分离中，常用的展开方式有（洗脱展开法）、（前沿分析法）、（置换展开法）。 21按照热能供给湿物料的方式不同，干燥可分为以下几类：（导热干燥）、（辐射干燥）、（介电加热干燥）、（对流干燥）。五、简答题1产品的分离提取工艺应考虑那些因素？ 答：某一具体产品的分离提取工艺与下列情况有关： (1)是胞内产物还是胞外产物； (2)原料中产物和主要杂质浓度； (3)产物和主要杂质的物理化学特性及差异； (4)产品用途和质量标准； (5)产品的市场价格； (6)废液的处理方法等。2与目的产物混合的杂质主要包括那些成分？ 答：与目的产物混合的杂质包括： 1.生物反应过程中的副产物； 2.未消耗完毕的原料； 3.生产过程中加入的化学试剂； 4.生产设备材料物质。3 微生物发酵液有那些特性？ 答：微生物发酵液的特性可归纳为： 发酵产物浓度较低，大多为1一10，悬浮液中大部分是水； 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； 固体粒子可压缩性大； 液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。 这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。4 除去发酵液杂蛋白质的常用方法有那些？ 答：杂蛋白质的除去常用方法： (1)沉淀法：蛋白质是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子（三氯乙酸盐、水扬酸盐）形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子（Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等）形成沉淀。 (2)变性法：使蛋白质变性的方法很多，如：加热，调节PH，有机溶剂，表面活性剂等。其中最常用的是加热法。 (3)吸附法：加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。5 溶剂萃取法有那些优点？ 答：有以下优点： 比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好、传质快；比蒸馏法能耗低。另外它还有生产能力大、周期短、便于连续操作、容易实现自动化控制等优点。6 溶解过程的能量变化分那三个过程？ 答：(1)溶质B各质点的分离；原先是固态或液态的溶质B先分离成分子或离子等单个质点。此过程需要吸收能量，这种能量的大小通常与分子之间的作用力有关； (2)溶剂A在溶质B的作用下形成可容纳B质点的空位；此过程也需要吸收能量，其大小与溶剂分子A之间的相互作用力有关；该能量还与溶质分子B的大小有关。 (3)溶质质点B进入溶剂A形成的空位；此过程放出能量。7 反胶团萃取技术有哪些优点？ 答： 1)有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性； 2)分离、浓缩可同时进行，过程简便； 3)能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题； 4)由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶； 5)反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。8 乳化液膜有哪些优点？答：(1)具有选择性；(2)较高的浓缩能力；(3)连续运转的可能性；(4)前处理方便或无需前处理；(5)经济性好。9亲和色谱中选择理想载体有什么特征？ 答：理想载体的特性： (1)不溶性； (2)渗透性，即具有疏松的网状结构，容许大分子自由通过； (3)高硬度及适当的颗粒形式，最好为均匀的珠状； (4)最低的吸附力； (5)较好的化学稳定性； (6)抗微生物和酶的侵蚀； (7)亲水性； (8)具有大量的供反应的化学基团，能与大量配基共价连接。10 按原理分类，色谱分离方法有哪几类？答：（1）按溶质分子与固定相相互作用的机理不同，色谱分离可大致分成如下5大类：吸附色谱分离，分配色谱，离子交换色谱，凝胶色谱，亲和色谱。（2）根据固定相的形状不同，色谱分离技术可分为柱色谱分离、纸上色谱分离、薄层色谱分离。 （3）根据流动相的物态不同，色谱分离技术可分为气相色谱分离、液相色谱分离、超临界色谱分离。 （4）根据操作压力不同，色谱分离技术不同可分为低压色谱分离、中压色谱分离、高压色谱分离。 11 结晶过程中，晶核的形成有那几种形式？ 答：有三种形式： (1)初级均相成核：溶液在不含外来物体时自发产生晶核，称为初级均相成核。 (2)初级非均相成核：在外来物体(如大气微尘)诱导下产生晶核的现象称为初级非均相成核。 (3)二次成核：溶液中已有溶质晶体存在的条件下形成晶核的现象称二次成核。二次成核中又以接触成核占主导。12 影响接触成核速率的因素有那些？ 答：影响接触成核速率的因素有： (1)过饱和度的影响：产生的晶粒数N是过饱和度S的函数。无论哪一类晶体，晶核生成量与晶体生长速率成正比。 (2)碰撞能量E的影响：碰撞能量纯越大，产生的晶粒数越多。 (3)螺旋桨的影响：螺旋桨对接触成核的影响最大，主要体现在它的转速和桨叶端速度上。 (4)晶体粒度的影响：晶体粒度大，碰撞能量大，则晶核生成量增加。当悬浮晶粒随溶液循环而流经桨叶的旋转平面时，并非所有粒度的晶粒都有机会与桨叶相接触。只有当晶体大于某一粒度值后才能和桨叶碰撞产生二次晶核。也就是说小晶粒在循环中难与螺旋桨接触。 (5)螺旋桨材质的影响：聚乙烯桨叶与不锈钢桨叶相比晶核生成量相差4倍以上，软的桨叶吸收了大部分碰撞能量，使晶核生成量大幅度减少(也有晶核的生成与材质无关的报道)，一般情况下，低转速时，桨叶材质的影响要突出些。13 与常压蒸发相比，减压（真空）蒸发有那些优点？有哪些缺点（缺点这点老师没说考）？ 答：与常压蒸发相比，它有以下优点： (1)溶液沸点低，可用温度较低的低压蒸汽或废蒸汽作加热蒸汽。 (2)溶液沸点低，同样蒸汽，所需的传热面小。 (3)沸点低，有利于处理高温下易分解和变质的热敏性物料。 (4)蒸发器的操作温度低，系统的热损失小。减压（真空）蒸发的缺点： (1)溶液温度低，粘度大热系数小。 (2)蒸发器和冷凝器的内压力低于大气压，完成液和冷凝水需用泵或大气腿徘出。 (3)需用真空泵抽出不凝性气体，保持一定真空度，需多耗能。14 “清洁生产”应该包括哪三方面的内容？ 答：(1)清洁生产工艺技术和过程：含先进的无废少废技术、高效的装备和完善的管理； (2)清洁产品：使用中和使用后对人体和环境无害； (3)清洁能源：包括常规能源清洁利用、采用节能技术、再生 能源和新能源的开发利用。15双水相萃取技术有哪些优势？答：ATPE作为一种新型的分离技术，对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势： (1)含水量高(70-90)，在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性； (2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤； (3)分相时间短，自然分相时间一般为5min15 min； (4)界面张力小(10-7 10-4mNm)，有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的接触角几乎是直角； (5)不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害； (6)大量杂质可与固体物质一同除去； (7)易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理； (8)操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行； (9)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。 六、论述题1.(书本P59 4)用碟片式离心机分离大肠杆菌基因工程菌悬浮液，已知大肠杆菌的最小颗粒为d=1.0m（化为10-6m）；离心机的角速度=880rad/s，碟片数n=72，倾斜角速度=38，碟片内径r1=0.036m，外径r2=0.081m；固体密度S=1050kg/m3，液体密度L=1020kg/m3，液体粘度=1.0210-3Pas。 (1)求上述分离条件下离心机最大生产能力。 (2)若细胞破碎后离心，此时料液粘度上升至=8.010-3Pas，其余条件不变。如果要分离的最小细胞碎片为d=0.2m，试确定其离心机的最大生产能力。 (3)计算结果说明了什么？ 解：（1）最大生产能力公式： 单位：其中： 单位：m/s 由上可得：（A）代入相应数值可得 （2）代入相应数值到A式可得 （3）说明该碟片式离心机的生产能力不高（仅供参考）。2.超临界流体萃取-CO萃取剂优点有哪些? 答：用超临界萃取方法提取天然产物时，一般用CO2作萃取剂。这是因为： (1)临界温度和临界压力低(Tc=31.1，Pc=7.38MPa)，操作条件温和，对有效成分的破坏少，因此特别适合于处理高沸点热敏性物质，如香精、香料、油脂、维生素等； (2)CO2可看作是与水相似的无毒、廉价的有机溶剂； (3)CO2在使用过程中稳定、无毒、不燃烧、安全、不污染环境，且可避免产品的氧化： (4)CO2的萃取物中不含硝酸盐和有害的重金量，并且无有害溶剂的残留； (5)在超临界CO2萃取时，被萃取的物质通过降低压力，或升高温度即可析出，不必经过反复萃取操作，所以超临界CO2萃取流程简单。 因此超临界CO2萃取特别适合于对生物、食品、化妆品和药物等的提取和纯化。3.在微生物细胞破碎技术中，机械法与非机械法有什么不同。 答：破碎方式分为机械法与非机械法。机械法包括以固体剪切力作用为机理的珠磨法与压榨法，以液体剪切力为作用机理的高压匀浆和超声波破碎法。非机械法包括干燥处理手段和以溶胞作用为机理的酶溶法、化学法、物理法。二者相比各有特点，同时也有自身局限性，以下是二者之间的不同。 （1）破碎机理：机械法应用高压或研磨剂，使细胞悬液在加速碰撞下迅速破碎，应用剪切作用，相对剧烈的切碎细胞，而非机械法运用化学试剂对细胞壁和膜的作用，改变通透性，以溶解局部壁膜的温和方式。 （2）碎片大小：机械法通过高压碰撞，剪切磨损已将细胞打成细小碎片，以至于匀浆中成分复杂，不易分离胞内物。非机械法只作用于细胞表面，所以在细胞大小方面，碎片较大，外形较完整，碎片少，易于初步分离。 （3）内含物释放：机械法可以将内含物全部释放，而非机械法部分释放，由微生物结构特性以及不同细胞对化学渗透剂的不同作用所致，破碎难易度不同，对试剂作用不同。 （4）黏度：核酸释放的多少影响到黏度。机械法释放的核酸多，黏度高，非机械法基本不破坏细胞核，因此核酸释放少，浆液黏度低，便于进一步提取。 （5）时间效率：机械法作用时间短，效率高。而非机械法作用时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过百分之五十，而处理时间则长达2小时以上，所以往往需要添加还原剂保护，以防止活性损失太多，通常为提高收率而采用较高实际浓度，试剂用量大，成本高，也给后处理带来不便。 （6）设备：机械法需用专用设备如高压匀浆器，珠磨机。因此在工业生产上应用较广，而非机械法不需用专用设备，只须用化学试剂，控制好温度等条件既可。 （7）通用性：机械法通用性较强，除对仪器有堵塞作用如团状或丝状真菌以及较小的革兰阳性菌不适用高压匀浆器之外，一般大部分微生物细胞可采取机械法处理，而非机械法通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。 （8）经济方面：机械法只须用特定的仪器，控制条件方便容易变化不大，所以成本低。非机械法所用相应的化学试剂，培养时间长，成本高。 （9）应用范围：机械法适用于实验室，工业范围，非机械法适用于实验室范围。 机械法高效，廉价，简单，而得以工业化应用，但敏感性物质失活问题，碎片去除以及杂蛋白太多等问题仍要解决。4.论述反渗透、超滤、微孔过滤、纳米过滤的异同点。 答：它们的特性论述如下： （1）反渗透法比其他的分离方法(如蒸发、冷冻等方法)有显著的优点：相态不变，无需加热，设备简单，效率高，占地小，操作方便，能量消耗少等。 应用：如海水的脱盐，食品医药的浓缩，超纯水的制造，以及对微生物的分离控制等许多方面。 （2）超滤：能截留相对分子质量在500以上的高分子的膜分离过程。 优点：相态不变无需加热，所用设备简单，占地面积小，能量消耗低。操作压力低，泵与管对材料要求不高等。 反渗透法必须施加较高的压力，而超滤的操作压力较小。 问题：与反渗透法相比，水通量大得多，其动力费用较大。和其他浓缩方法相比，通常只能浓缩到一定程度。 （3）微孔过滤主要分离流体中尺寸为0.110um的微生物和微粒子。 优点：膜厚度薄，孔径均一，空隙率高，滤速快，吸附少和无介质脱落。 问题：膜性脆易碎，机械强度差，须把它衬贴在平滑的多孔支撑体上。 应用：实验室中，主要用于微生物检测、微粒子检测。 工业上，主要用于灭菌液体的生产；反渗透及超滤的前处理；电子工业中超纯水制造和空气过滤。 （4）纳米过滤：是介于超滤和反渗透之间，以压力差为推动力，从溶液中分离出300-1000相对分子质量物质的膜分离过程。 特点：(1)能截留小分子的有机物，并可同时透析出盐，即集浓缩与透析为一体。 (2)操作压力比反渗透低，因无机盐能通过。节约动力。5. 利用离心法和过滤法进行固液分离的原理、常用设备及优缺点。 （一）离心法： 原理：离心机是利用转鼓高速转动所产生的离心力，来实现悬浮液、乳浊液分离或浓缩的机械，由于离心力场所产生的强大离心力，所以利用离心分离可分离悬浮液中极少的固体微粒和大分子物质。 常用设备：按其作用原理不同，可分为过滤式离心机和沉降式离心机两大类。前者转鼓上开有小孔，有过滤介质。主要用于处理悬浮液固体颗粒较大、固体含量较高的场合。后者转鼓上无孔，不需过滤介质。主要用于处理固液、液液固等分离。 优点：具有分离速率快，分离效率高、液相澄清度好。 缺点：设备投资高、能耗大，此外连续排料时，固相干度不如过滤设备。 （二）过滤法： 原理：悬浮液通过过滤介质时，固态颗粒与溶液分离。 根据过滤机理不同，过滤操作分为澄清过滤和滤饼过滤。 在澄清过滤中，所用的过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，填充于过滤器内即构成过滤层；也有用烧结陶瓷、烧结金属、粘合塑料及用金属丝绕成的管子等组成的成型颗粒滤层，当悬浮液通过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清。此法适用于固体含量少于0.1g/100ml、颗粒直径在5100m的悬浮液的过滤分离。 滤饼过滤中，过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布;毡、石棉扳、玻璃纤维纸、合成纤维等无纺布。滤饼过滤按推动力的不同可以分为四种，即重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤。 优点：固相干度好，无需设备，能耗低，经济成本低。 缺点：容易形成滤饼，分离效率低。6. 论述细胞壁破碎常用的五种方法。 答：细胞壁破碎常用的五种方法有珠磨法、高压匀浆法、超声波法、酶溶法和化学渗透法。 （1）珠磨法：利用进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的研磨剂一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎释放出内含物。 优点：珠磨机连续操作时兼具破碎和冷却双重功能，减少了产物失活的可能性，在适当条件下一次操作即可达到较高的破碎率，适合于各种微生物细胞的破碎。 缺点：操作参数多，一般凭经验估计，在大规模操作中，夹套冷却控温难度大。 （2）高压匀浆法：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。 优点：操作参数少，适合于大规模操作， 缺点：不适合于丝状真菌及含有包涵体的基因工程菌。破碎率较低，往往需循环2-4次才能达到较高的破碎率，容易引起产物的失活的可能性，需配备换热器进行级间冷却。 3）超声破碎法：通常采用的超声破碎机在1525kHz的频率下操作。 优点：操作简便，液量损失少，适合实验室规模。 缺点：易引起温度的剧烈上升，在大规模操作中，声能传递和散热困难，产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。 4)酶溶法：利用酶反应,分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。 优点：选择性释放产物，条件温和，核酸泄漏量少，细胞外形完整。 不足：价格高，限制了大规模应用，通用性差，不同菌种需选择不同的酶，不易确定最佳的溶解条件；产物抑制的存在。 5)化学渗透法：某些化学试剂如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、变性剂等通过改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。化学渗透法取决于化学试剂的类型以及细胞壁的结构与组成。 优点：(1)对产物释放具有一定选择性。(2)细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 缺点：(1)通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。(2)时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50。(3)有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中需设法分离除去。气相色谱中内标法与外标法的应用一、内标法 1.什么叫内标法?怎样选择内标物? 内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。 内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。 2.在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值? 影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。 由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。 化学方面的因素包括： 1、内标物在样品里混合不好； 2、内标物和样品组分之间发生反应， 3、内标物纯度可变等。 对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定， 3.在制作内标标准曲线时应注意什么? 在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。 二、外标法 用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。此法可分为工作曲线法及外标一点法等。工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。 外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量： WA(W)(A) 式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面积。(W)及 (A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。 外标法 external standard method 色谱分析中的一种定量方法，它不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。三、定量分析中怎样选择内标法或外标法(来源：药物分析网） 选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（当然是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法公式计算即可。 内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。 选择内标物有四个要求：1.内标物应是该试样中不存在的纯物质；2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；3.加入内标物的量应接近于被测组分；4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。 内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。 外标法简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。 内标与外标都是定量的一种方法而已，至于哪一种方法好与不好不能一概而论，做不同的分析，面对着不同的要求，再加上分析成本分析效率等等问题，我想简单而有效进行定量分析来满足要求才是最重要的。 1、以前做过很多医药、农药中间体的芳香族卤代化合物的常量定量分析，没有自动进样器，用外标法定量，确实重现性与稳定性非常差，结果经常受到搞合成同事的质疑。其实，仔细分析原因不一定就是外标法不适合这种定量分析，首先我们的实验室仪器和手段是否调整到一种稳定而合理的状态了，比如，衬管是否洁净，玻璃棉的位置是否合适恰当（能否使样品尽可能的汽化）、汽化温度是否合适、色