铜(Ⅱ)和镍(Ⅱ)与N,O-席夫碱配体.doc

铜（）和镍（）与N,O-席夫碱配体的合成，结构和脲酶抑制研究摘 要五单核铜（II）和镍（II）的席夫碱配体配合物是由4-羟基苯乙胺和2-苯基乙胺合成的，然后用单晶X-射线分析这些物质。这些复合物的晶体结构显示出其平面正方形上的配位金属几何中心。对所有得到的复合物进行了四季豆活性抑制的测试。结果发现，席夫碱铜（II）配合物，即Cu（C15H13BrNO2）22（C6H7N）（1）中的Cu（C15H12Br2NO 2）22（DMF），铜（C19H16NO2）2（3）和Cu（C19H16NO）2（5），显示出对四季豆脲酶（IC50=1.45-3.59M）有较强的抑制活性的。而Schiff碱镍（II）配合物，Ni（C19H16NO2）22（DMF）（4）呈现出微弱的抑制活性（IC50 50微米）。对其结构和活性关系进行进一步的讨论。1. 介绍尿素酶（尿素水解酶，EC3.5.1.5）是一种含镍的酶，它是由尿素在各种藻类、细菌、真菌和植物的作用下迅速水解形成氨和氨基甲酸叔丁酯。它参与环境氮转换，为这些生物的生长提供了氮源。另一方面，双核镍脲酶的活性位点的催化反应导致的累积氨和pH值的突然增加，在农业和健康有负面的副作用。例如，脲酶是肾结石、肾炎、胃溃疡和其他一些疾病的病原体；另外的，脲酶会降低尿素肥料的使用效率，并释放大量的氨，然后通过氨的毒性和增加土壤的毒性进一步诱导对植物的损伤。因此，利用脲酶抑制剂抑制尿素酶的水解是一个重要的目标。最近，脲酶抑制剂的研究已经得到了越来越多的关注，一些脲酶抑制剂也已经被报道。在已知的脲酶抑制剂中，异羟肟酸、磷和硫醇类是公认的额最好的尿酶抑制剂。然而，尿酶抑制剂队植物、细菌和真菌的效率较低并且有副作用，所以迄今为止，新的和更有效的尿酶抑制剂的研究只能依赖扩展屏幕测试的方法。在早前的研究中，我们已经研究了一系列席夫碱金属配合物对四季豆脲酶活性的抑制左右，发现席夫碱金属配合物对四季豆脲酶活性具有抑制作用。一个有趣的现象是，金属中心的位置和取代基例如卤原子在芳香环上的位置在很大程度上影响到了生物活性，完整的机制现在还不是很清楚。作为继续，在本文中，我们对席夫碱铜的配合物1，2，3，5和席夫碱镍的配合物4进行了研究。这里，席夫碱配合物HL1，HL2，HL3由4 - 羟基苯乙基胺分别和5-溴水杨醛、3,5-二溴水杨醛、2 -羟基-1-萘甲醛合成，而配位体HL4由2 - 苯基乙胺和2-羟基-1 - 萘甲醛反应制备（方案1）。使用初步对接试验来了解它们结构和关系的过程在本文也进行了说明。2. 实验部分2.1 材料和物理测量脲酶（白凤豆，III型，活性22个单位/毫克固体），HEPES（超）缓冲区和尿素（分子生物学试剂）均购自Sigma。所有其他化学品和溶剂购自Aldrich，可直接使用，所有程序均采用蒸馏水，H1核磁共振光谱在Bruker DRX-500光谱仪上记录。化学位移采用四甲基硅玩的ppm作为内标。通过 Micromass GCTOF for EIMS (70 eV)获得质谱。使用Elementar公司的VARIO EL III元素分析仪进行元素分析。使用Nexus870 FT-IR分光光度计测量质谱，KBr压片在4000400 cm-1的范围内，紫外 - 可见光谱测定使用Shimadzu UV-160分光光度计使用DMSO-H2O（1:1 V / V）溶剂，在800-200纳米范围内测量。酶的抑制活性以BIO-TEK SYNERGYHT酶标仪计量。2.2 席夫碱配体HL1-4的合成的一般程序（HL3例子）4-羟基苯乙基胺（0.274克，2.0毫摩尔）加入到2-羟基-1-萘甲醛（0.344克，2.0毫摩尔）的20mL甲醇溶液中。在甲醇中于65下将混合物回流在1小时内。随后，溶液被过滤并保留在空气约7天，得到的HL3黄色块形晶体。产量：460毫克（79），熔点197（分解）。 1 H NMR（500 MHz时，D 6-DMSO）：13.99（1H），9.20（1H），8.99（D，J =10.5赫兹，1H），7.97-6.69（M，6H），7.08（，J=8.0赫兹，2H），6.67（D，J= 8.0赫兹，2H），3.82（吨，2H），2.87（T，2H）。 EI-MS（70 eV）的：M/Z291（M+，5）。 IR（KBr压，cm-1处）：3424，2908，2593，1633，1546，1510，1447，1365，1241，1190，1090，855，827，748，507，487，481，435，409。紫外-可见DMSO-H2O（1:1体积/体积），/ nm的（/M-1厘米-1）：416（12360），400（11760），308，268（12,510），262，252（20,070）（17,380）（10,130）。元素分析计算值C19H17NO2：C，78.33，H5.88，N，4.81。实测值：C，78.11，H5.96，N，4.602.3 通用方法制备复合1-5分别取席夫碱配体HL1-4各1mmol，溶解在10ml甲醇和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）按1：1比例配成的混合溶液中，然后加入0.5mmolCu(NO3)23H2O的5ml 4 - 甲基吡啶溶液或者0.5mmolNi(NO3)26H2O的5mL甲醇溶液，将得到的溶液在室温下搅拌30分钟然后过滤。将滤液保存在空气中，约7天，形成块状晶体。分离出结晶，用蒸馏水洗涤三次然后在含有无水氯化钙的真空干燥器中干燥。（4-甲基嘧啶） （1）棕黑色固体，产量：235毫克（53）。IR（KBr压，cm-1处）：3447，2901，2599，1618，1516，1460,1386，1322，1259，1174，1069，1013，823，701，648，512，484，431。紫外-可见DMSO-H2O（1:1体积/体积），/纳米（/M-1厘米-1）：370（9740），294（11850），258（28480）。C42H40Br2CuN4O4：C，56.80，H4.54，N，6.31计算值。值：C，56.96，H4.71，N，6.10。棕黑色固体，产量：282毫克（56）。IR（KBr压，CM-1）：3422，2929，1664，1620，1513，1446，1384，1321，1243，1157，1102，858，826，707，669，523，489，432。紫外-可见DMSO-H2O（1:1体积/体积），/ nm处（/M-1 cm-1处）：376（8550），268（20730），256（25270）。计算C36H38Br4CuN4O6：C，42.99，H3.81，N5.57。值：C，42.76，H3.92，N5.31。棕黑色固体，产量：200毫克（62）。 IR（KBr压，cm-1处）：3370，3062，2914，2856，1610，1546，1511，1439，1415，1364，1343，1305，1249，1190，1139，1097，1033，965，824，748，647，603，563，524，492，463，419。紫外-可见DMSO-H2O（1:1体积/体积），/纳米（/M-1厘米-1）：414（8,650）396（13,290）380（12,080）310（23,180）262（29,370）。C38H32CuN2O4：C，70.85，H5.01，N，4.35计算值。实测值：C70.71，H5.07，N，4.28。棕黄色固体，收率：188毫克（48）。 IR（KBr压，cm-1处）：3167，3062，2926，2809，1662，1611，1542，1511，1442，1412，1368，1344，1237年，1195，1142，1102，1058，1032，970，934，826，749，664，570，534，477，421。紫外-可见DMSO-H2O（1:1体积/体积），/纳米（/M-1厘米-1）：416（7,280）400（7,410）308（8,920）272（16,850）（17,730），263，252（19,710）。C44H46NiN4O6：C，67.27，H5.90，N，7.13计算值。发现：C，67.01，H5.97，N，7.01。棕黑色固体，产量：205毫克（67）。 IR（KBr压，cm-1处）：3444，3025，2907，1612，1540，1500，1462，1410，1365，1202，1091，1027，958，825，743，696，522，499，415。紫外 - 可见DMSO-H2O（1:1体积/体积），/纳米（/M-1厘米-1）：420（6330），400（6060），312（6780），248（11,660）。 C38H32CuN2O2：C，74.55，H5.27，N，4.58计算值。实测值：C，74.43，H5.36，N，4.33。2.4 晶体结构测定在Bruker SMART APEX II CCD衍射仪上用石墨单色钼K（=0.71073）辐射收集X-射线晶体学数据，用SAINT程序减少收集的数据，然后使用SADABS程序进行经验吸收校正。采用直接解决的办法计算出结构，然后使用SHELTXL5.1版本中的2全矩阵最小二乘法对结构进行完善。细化所有非氢原子的各向异性，所有其他的氢原子放置在理想的几何位置并限制在主原子的周围，席夫碱配体（HL2，HL3）和席夫碱金属配合物(1，2，3，4和5)的晶体学数据罗列在表1和表2中。2.5 测量四季豆脲酶抑制活性Tanaka的文献中提供了脲酶活性的测量结果，通常，含25L四季豆脲酶（12 KU/ L）和25微升不同浓度的测试配合物（溶解在在DMSO/H2O混合物（1:1体积/体积）的混合物，在37、96孔分析板下预温育1小时，预培养后，添加200L的100mM HEPES（N-2 - 羟基乙基哌嗪-N-2-乙磺酸）pH= 6.8的缓冲液，包含500mM尿素和0.002酚红，在37摄氏度选下培养。通过微板读数器测定整个反应（570纳米），需要产生足够的碳酸铵将HEPES的pH值从6.8到7.7，端点由酚红指示剂的颜色。2.6 对接模拟四季豆脲酶（蛋白质数据银行的条目3LA4）抑制剂的三维分子对接通过DOCK4.2程序软件来实现。当所有的氢原子加入，非极性碳原子合并到氢原子碳原子之后，在AutoDockTools(ADT 1.4.5)的图形用户界面设置每个抑制剂和酶之间的相互作用，镍的初始参数设置为R =1.170 A，Q=2.0，范德华尔斯肼的深度设为0.100千卡/摩尔。执行AutoDockTools的图形用户界面对目标蛋白的催化中心和外围的阴离子部位进行扫描，以评估模型化的脲酶抑制剂复合物的结合模式。通过拉马克遗传算法（LGA）计算柔性对接的配位体结构，在目标蛋白的周围搜索有利的配位体，席夫碱铜（）的配合物1,2,3,5和酶对接的活性位点如本组之前所述。3 结果与讨论3.1 合成水杨醛或水杨衍生物与伯胺缩合形成一种重要的双齿席夫碱配体，4-羟基苯乙基胺和相应的5-溴水杨醛、3，5-二溴水杨醛、2-羟基-1-萘甲醛在甲醇中反应得到席夫碱配体HL1、HL2和HL3，产率大概在70-80%，配体HL4是由2-苯基乙胺和2-羟基-1-萘甲醛反应制得。这些席夫碱配体是稳定的固定，可以在没有预防措施的情况下储存。通常情况下，席夫碱配体HL1-HL4可以溶解在极性溶剂如甲醇和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中。席夫碱配体HL1-HL4与相应的金属盐Cu(NO3)23H2O和Ni(NO3)26H2O以2:1的比例在常温下反应，生成铜（）的配合物1,2,3,5和镍（）的配合物4。经过一个星期的缓慢蒸发，可以从4-甲基嘧啶/甲醇溶液或DMF/甲醇溶液中分离出适合X-射线衍射的配合物1-5的晶体。光谱数据吻合良好的为席夫碱配合物1-5。3.2 光谱研究（补充资料）在结构发现的基础上和相关化合物的光谱进行对比，配合物1-5的红外光谱可以初步确定，在3447cm-1和3167cm-1之间的宽频带是由配合物1-5中的酚羟基引起的，1620cm-1和1610cm-1处的强吸收是由C-N键引起的，可以观察到，配合物2和3在相对于配体HL2和HL3在1643cm-1和1633cm-1处有相应的负位移，可以表明该亚胺氮原子处有相应的金属离子配位，配合物2和4在1664cm-1和1662cm-1处的强吸收是由C-O键所引起的，在1546cm-1和1500cm-1处有广泛的强吸收可以合理的解释为芳香环上的C-C键的骨架伸缩振动所引起的。席夫碱配合物1-5的紫外可见光谱在DMSO/H2O以体积比1:1的条件下进行测定。席夫碱铜（）的配合物1和2的电子光谱非常相似，在370nm附近有中等强度的波段，是由苯酚相对于金属离子发生电荷转移所引起的。相对于配合物1，配合物2的最大吸收波长发生蓝移，可能是3-溴取代基所带来的影响，在配合物3,4,5的电子光谱中，260nm处有强烈的高能量频带，可能是配体内部电荷发生（*）转移所引起的。在DMSO/H2O混合液中形成的配合物3和5在310nm和312nm处有广阔的电荷转移带，同时，由于电荷传输带的原因，紫外在380nm和420nm之间的肩部有一定的变化。配合物3的紫外可见光谱相对于自由配体HL3在388nm处发生蓝移，类似的，我们观察了镍（）的席夫碱配合物4和自由配体HL3，但是配合物4在308nm,400nm,416nm处的吸收略低于自由配体HL3。所有的配合物1-5的电子光谱中，没有检测到d-d转换的频带，可能是因为电荷转移的强度和内配体过渡造成的。3.3 晶体结构描述研究表明，席夫碱配体HL1、HL2、HL3、HL4非常相似（图1），单齿的N-O配体可以通过酚羟基的去质子化使其显示出单阴离子性，类似的，我们的小组已经通过水杨醛和4-羟基苯乙基胺的缩合合成了N,O-双齿螯合席夫碱物种，不幸的是，席夫碱配体HL1和HL4不能结晶成适合X射线单晶衍射研究的晶体，因此，只确定了HL2和HL3的晶体结构。席夫碱配体HL2和HL3的固态结构分别入图1和图2所示。由3,5-二溴苯甲醛和2-羟基-1-萘甲醛所衍生的配体HL2和HL3中，C-N键的键长分别为1.286（6）和1.307（3），席夫碱金属配合物的通式为M(L)2，其中L=L1，L2,L3和L4，它是由当量的席夫碱配体HL1-4与金属离子（M=Cu2+，Ni2+）结合而成的。配合物1-5的分子结构通过单晶X-射线分析确定，如图3-7。所有的五个配合物均为平面正方形构型，两个亚胺氮原子和两个酚氧原子在两个席夫碱配体（L）的反位上形成四配位体，五个配合物金属中心的键长和键角如表3所示。分别对席夫碱铜（）配合物1和2中的单斜晶系C2/ C（第15号），空间群和三斜晶系P-1（第2号）进行单晶X-射线衍射测定，如图3和4所示，配合物1和2为Cu(L1)22(4-羟基苯乙基胺)和Cu(L2)22DMF的单核铜（）形式，得到反式四方形CuN2O2，其中铜原子位于反转中心的位置。配合物1的Cu-O和Cu-N的平均键长分别为1.882（2）和2.004（2），略短于配合物2的键长，配合物2的键长分别为1.906（2）和2.010（2），可能是由于溴取代基的吸电子效应。这表明，溴原子在芳环上的位置对配体的协调能力有重要的影响。配合物1的晶体中的Cu基团通过氢键和两个共晶的4-甲基嘧啶相接（图3）。配合物2中的Cu基团通过氢键和两个DMF分子相接（图4）。X-射线晶体结构表明配合物3和4分别为单晶的铜（）和镍（）的物种，这两个配合物具有相同的螯合席夫碱配体HL3的二齿主链和相同的金属配位系统。和配合物3相反的，配合物4的晶体结构由一个离散的单核镍基团和两个DMF分子点阵组成。镍（）原子在基团中的位置非常类似于观察到的配合物3。我们的小组也已经报道了类似的由4-羟基苯乙基胺配体制得的铜（）和镍（）的席夫碱配合物，Ni1-O1和Ni1-N1的键距分别为1.825（2）和1.911（2）,与对应的报道中的方形平面镍（）配合物想照应。在化合物4 的镍基团上还通过分子间氢键连有两个DMF分子。和配合物1-3相比，由2-苯基乙胺所制得的席夫碱铜（）配合物5的固体晶体结构中含有两个独立的晶体学分子。The molecular structure of one of the two rather similar complex units, Cu(L4)2,is represented in Fig. 7.The copper(II) atom in each mononuclear Cu(L4)2 unit of 5 also lies on a crystallographic inversion center (symmetry codes: 1x, 1y, 1z for Cu1; 1x, 2y, z for Cu2). The average bond distances of Cu1O1 and Cu1N1 are 1.879(2) and 1.998(2), respectively,while the average bond distances of Cu2O2 and Cu2N2 are 1.881(2) and 2.006(2).3.4 四季豆尿素酶的抑制活性对席夫碱配体HL1-4和相应的铜（）配合物1,2,3,5，镍的配合物4对四季豆脲酶的抑制性进行了筛选（见表4），结果发现，所有的配体HL1，HL2，HL3，HL4没有表现出对四季豆尿酶的抑制性。与标准的抑制剂乙酰氧肟酸（AHA，IC50=63.00微米）相比，席夫碱铜（）配合物1，2，3和5对四季豆尿酶显示出有效的抑制性。一般来说，重金属离子被认为是通过和半胱氨酸的巯基及可能的氮-（组氨酸）和氧（天门冬氨酸和谷氨酸酸）中的脲酶的活性位点相结合从而产生脲酶抑制性的。因此，可以看出铜（）离子的协同作用导致了抑制活性的改变。应当指出，席夫碱铜配合物对四季豆脲酶活性的抑制顺序为： 3125。这里，当溴作为芳香环上的取代基时，由于吸电子性的差异，配合物1比配合物2更有效。有趣的是，由4-羟基苯乙基胺制得的配合物3比由2-苯基乙胺制得的配合物5更有效，这定义了在芳环上取得效果的最小取代模式。在已测的四种席夫碱铜配合物1,2,3,5中，观察到的最有效的活性配合物只有配合物3。这些观察和之前报道的由4-羟基苯乙基胺所合成的席夫碱铜配合物相一致。在相同的条件下，跟配合物3比起来，席夫碱镍的配合物4的脲酶抑制活性就要弱上一些。结果表明，席夫碱金属配合物作为脲酶抑制剂，其抑制作用不仅取决于有机配体，还取决于核心离子。3.5。分子对接研究用DOCK程序模拟席夫碱铜配合物1,2,3,5和四季豆脲酶的结合模型，来验证其构效关系（图8），结果显示出复杂的分子填充在四季豆脲酶的内部，因为螯合酚氧原子和四季豆脲酶的位氨基酸具有灵活性，所以在相互作用的基础上已经建立了各种构象。在最佳的脲酶构象模型中通过能量水平选出优化集群（出现20次），铜配合物和位氨基酸的结合能分别为 7.60 kcal/mol, 6.62 kcal/mol, 3.64 kcal/mol,3.36 kcal/mol，最低的分子间能量为9.79 kcal/mol, 8.81 kcal/mol, 5.84 kcal/mol, 5.70 kcal/mol，此外，一些疏水相互作用也存在于尿酶抑制剂中。配合物1和2与酶的活性部位的结合方式如图8a和b所示，应当注意的是，酚氧原子的配合物1和2分别与Arg439侧链上的N-H键形成氢键，化合物1中Arg439的N-HO的键长和键角为2.652(2)和140.8(2),化合物2中的为2.907(2)和143.