2种检测人肾综合征出血热IgG抗体ELISA试剂盒的比较.docx

2 种检测人肾综合征出血热IgG 抗体 ELISA 试剂盒的比较李卓，曾汉玉，马樱，刘媛，张戎，刘美宁，陈丽华摘要 目的 探讨国产与进口人肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）IgG 抗体 ELISA 检测试剂 盒的性能差异。 方法 采用国产和进口 ELISA 试剂盒分别检测 50 例 HFRS 疫苗接种者血清样本中抗人 HFRS IgG 抗体含 量，分析比较 2 种 ELISA 试剂盒的一致性、灵敏性、精密度以及方法学等的差异。 结果 2 种 ELISA 试剂盒的精密度良好， 批内变异系数均5%；2 种试剂阳性一致率为 100%，阴性一致率为 20%，相似率为 60%；灵敏性检测结果显示，2 种 ELISA 试 剂盒的灵敏性差异较大（P0.05），国产 ELISA 试剂盒的灵敏度约是进口 ELISA 试剂盒的 5 倍。 结论 国产人 HFRS IgG 抗体 ELISA 检测试剂盒灵敏性好，进口 ELISA 试剂盒特异性好，国产和进口 ELISA 试剂盒的精密度均良好，在实际应用中应根据 具体情况合理选用。关键词 汉坦病毒；肾综合征出血热；抗体；酶联免疫吸附测定中国图书资料分类号 R373.32；R512.8文献标志码 A文章编号 1007-8134(2015)02-0092-04Comparison of two ELISA kits for the detectionof the IgG antibodies against hemorrhagic fever with renal syndromeLI Zhuo, ZENG Han-yu, MA Ying, LIU Yuan, ZHANG Rong, LIU Mei-ning, CHEN Li-hua* Department of Immunology, the Fourth Military Medical University, Xian, Shaanxi 710032, China*Corresponding author, E-mail: Abstract Objective To investigate the performance differences in detecting hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) IgG Antibodies between domestic and imported ELISA kits. Methods Domestic and imported ELISA kits were used to detect HFRS IgG antibodies of the serum samples from 50 HFRS vaccinators, and the consistency, sensitivity, precision and methodology of the two ELISA kits were analyzed. Results Precision test showed that both the domestic and the imported ELISA kits had good precision, with the batch coefficient of variation of less than 5%. The positive consistency rate of the two ELISA kits was 100%, the negative consis- tency rate was 20% , and the similarity rate was 60% . The sensitivity of the domestic ELISA kits was 5 times higher than that of the imported ELISA kits, and the difference was significant between the two ELISA kits (P0.05). Conclusions The sensitivity of the do- mestic ELISA kits is higher than that of the imported ELISA kits, the specificity of the imported ELISA kits is higher than that of the domestic ELISA kits, and both the domestic ELISA kits and the imported ELISA kits have good precision for the detection of HFRS IgG antibodies. The selection and application of the domestic or the imported ELISA kits depend on specific requirements.Key words Hantaan virus; hemorrhagic fever with renal syndrome; antibodies; enzyme-linked immunosorbent assay肾综合征出血热 （hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）是一种由汉坦病毒感染引起，以发 热、 出血和急性肾损伤为特征的急性传染病，90% 以上病例发生在中国1，病死率为 0.1%10% 2，是 我国亟待控制的急性传染病之一。 该病毒在我国流 行的血清型主要是型汉滩病毒（Hantaan virus, HTNV）和型汉城病毒（Seoul virus, SEOV）3-4， 分别是我国姬鼠型和家鼠型疫 区的主要流行毒 株5。 此病是一种自然疫源性传染病， 四季均可散 发，每年 11 月至次年 1 月是其高发季节。 我国对重 点疫区的健康人群免费接种 HFRS 疫苗6，通常应 用 ELISA 法检测 HFRS 抗体的产生情况来评价疫苗的接种效果7。 ELISA 法以其灵敏、特异、简便等基金项目 国家科技重大专项（2013ZX1004609）；国家自然科学 基金青年项目（81401297）作者单位 710032 西安，第四军医大学免疫学教研室（李卓、曾汉 玉、马樱、刘媛、张戎、陈丽华）；710054，西安市卫生学校医学检验教 研室（李卓）； 712046，咸阳市疾病预防控制中心（刘美宁） 通讯作者 陈丽华，E-mail: 特点已被广泛应用于各个领域8-9，但不同试剂盒的 检测性能有所差异。 本研究对国产和进口人 HFRS 抗体 ELISA 检测试剂盒的性能进行了比较，旨在为 临床疾病的诊断和疫苗免疫效果的监测提供理论 和实验依据。1 材料与方法1.1 材料 50 份血清样本来自陕西省乾县 HFRS疫苗接种者。1.2 主要试剂和仪器 人 HFRS 抗体检测试剂盒（ELISA 法）（以下简称国产 ELISA 试剂盒） 由上海 市西唐生物科技有限公司生产； 汉坦病毒 IgG/IgM ELISA 检测试剂盒 （以下简称进口 ELISA 试剂盒） 由德国 IBL 公司原装进口；HFRS 抗体检测试剂盒（胶体金法）（以下简称胶体金法试剂盒） 由厦门市 波 生 生 物 技 术 有 限 公 司 生 产 。 检 测 仪 器 为 美 国 BIO-RAD Model 550 型酶标仪。1.3 检测方法 按照各种检测试剂盒的使用说明书操作。 国产和进口 ELISA 试剂盒的基本操作流 程：稀释血清、加样、洗涤、加酶结合物、洗涤、显色、 终止后自动酶标仪读值以及判定结果。 胶体金法试 剂盒基本操作流程：稀释血清、加样以及判定结果。 1.4统计学处理应用 SPSS 16.0 软件对实验结果 进行统计分析。 列四格表，计算相应的指标。 组间滴 度差异性检验用 Wilcoxon 秩和检验，P0.05 表示 差异有统计学意义。2结果2.1 国产和进口 ELISA 试剂盒一致性 按照国产 和进口 ELISA 试剂盒对阴性和阳性结果的判定标 准， 在 50 份标本中，2 种试剂盒检测 HFRS IgG 抗 体结果均为阳性的标本有 25 份，均为阴性的标本有 5 份。 国产试剂盒相对于进口试剂盒阳性一致率为100%，阴性一致率为 20%，相似率为 60%（表 1）。异系数为 3.3%， 进口 ELISA 试剂盒的批内变异系 数为 2.4%，说明 2 种 ELISA 试剂盒精密度均较好。 2.4 国产和进口 ELISA 试剂盒与胶体金法试剂盒 检测结果的一致性2.4.1 国产 ELISA 试剂盒与胶体金法试剂盒的一 致性 按照国产 ELISA 试剂盒与胶体金法试剂盒 对阴性和阳性结果的判定标准， 在 50 份标本中，2 种方法检测 HFRS IgG 抗体结果均为阳性的标本有 33 份，均为阴性的标本有 5 份。 国产 ELISA 试剂盒 相对于胶体金法试剂盒阳性一致率为 100%， 阴性 一致率为 29%，相似率为 76%（表 3）。表 3 国 产 ELISA 试剂盒与胶体金法 试 剂 盒 检 测 HFRS IgG 抗 体 的 一 致 性(份)Table 3 Consistency between the domestic ELISA kits and the colloidal gold method kits for the detection of HFRS IgG antibody (samples)胶体金法试剂盒国产 ELISA 试剂盒合计表 1 国 产 和 进 口 ELISA 试 剂 盒 检 测 HFRS IgG 抗 体 的 一致 性(份)阳性阴性阳性3312 45 阴性 0 5 5 Table 1Consistency between domestic and importedELISA kits for the detection of HFRS IgG antibody (samples)合计3317 50注：阳性一致率=33（/ 33+0）=100%；阴性一致率=5（/ 12+5）=29%； 相似率=（33+5）/50=76%国产 ELISA 试剂盒 进口 ELISA 试剂盒 合计阳性阴性阳性2520 45阴性05 5 合计 25 25 50 注： 阳性一致率=25（/ 25+0）=100%； 阴性一致率=5（/ 20+5）= 20%；相似率=（25+5）/50=60%2.2 国产和进 口 ELISA 试剂盒灵敏性比较 HFRS 疫苗接种者 HFRS IgG抗体阳性血清倍比稀释后分 别用国产和进口 ELISA 试剂盒进行检测，按照 2 种 试剂盒各自的判断标准，选取最大稀释比例的阳性 孔作为其检测灵敏性的数值（表 2）。结果表明，国产 ELISA 试剂盒检测 10 份 HFRS IgG 抗体阳性样本 的滴度大约高于进口 ELISA 试剂盒的 5 倍，说明国 产 ELISA 试剂盒的灵敏性优于进口 ELISA 试剂盒。 2.3 国产和进口 ELISA 试剂盒精密度比较 分别 用 国 产 和 进 口 同 一 批 次 ELISA 试 剂 盒 检 测 1 份 HFRS IgG 抗体阳性血清，同时做 20 孔，计算检测 结果的批内变异系数。 国产 ELISA 试剂盒的批内变2.4.2 进口 ELISA 试剂盒与胶体金法试剂盒的一 致性 按照进口 ELISA 试剂盒与胶体金法试剂盒 对阴性和阳性结果的判定标准， 在 50 份标本中，2 种方法检测 HFRS IgG 抗体结果均为阳性的标本有 25 份，均为阴性的标本有 17 份。 进口 ELISA 试剂 盒相对于胶体金法试剂盒阳性一致率为 76%，阴性 一致率为 100%，相似率为 84%（表 4）。2.5 国产和进口 ELISA 试剂盒的方法学比较 见 表 5。3 讨 论当人体感染汉坦病毒或接种 HFRS 疫苗后不 久，在血清中就可检测到 HFRS 抗体，最早产生的 是 HFRS IgM 抗体， 在 710 d 达到高峰，HFRS IgG 抗体在发病大约 2 周时出现， 可持续数年。 检测 HFRS IgM 抗体常用于疾病的早期诊断，检测 HFRS IgG 抗体对于 HFRS 的诊断、 流行病学调查和疫苗表 2 国 产 和 进 口 ELISA 试剂盒检测结果的灵敏性比较 （滴 度 ）Table 2 Comparison of the detection sensitivity obtained with the domestic and imported ELISA kits (titer)样本编号123456789101:25601:12801:25601:51201:25601:102401:51201:51201:204801:102401:3201:3201:6401:6401:3201:6401:6401:3201:25601:640试剂盒国产 ELISA 试剂盒 进口 ELISA 试剂盒注：2 组比较用 Wilcoxon 秩和检验，P0.01表 4 进 口 ELISA 试剂盒和胶体 金法试剂盒检测 HFRS IgG 抗 体 的 一 致 性(份)Table 4 Consistency between the imported ELISA kits and the colloidal gold method kits for the detection of HFRS IgG antibody (samples)胶体金法试剂盒进口 ELISA 试剂盒 阳性 阴性 合计阳性250 25阴性817 25合计3317 50注： 阳性一致率=25（/ 25+8）=76%； 阴性一致率=17（/ 17+0）= 100%；相似率=（25+17）/50=84%灵敏度差异较大。本实验结果表明国产 ELISA 试剂盒的阳性检 出率高于进口 ELISA 试剂盒，这可能与国产 ELISA 试剂盒采用 SPA 替代抗人 IgG 抗体有关。 既往实验 表明，SPA 替代抗人 IgG 抗体有如下特点：SPA 制 备容易，性质稳定，易于纯化，能应用于人和多种哺 乳动物的 IgG，不受种属限制，可制成通用试剂，价 格较低廉， 而抗人 IgG 抗体的制备须多次免疫动 物， 在应用上要受同种属的限制11；SPA 的结合力 强，相当于游离抗体与抗原的结合力，结合后对 IgG12表 5 国 产 和 进 口 ELISA 试剂盒的方法学比较 的活性无影响；SPA 无论在 0、37、44、56 均能Table 5 Comparison of the methodology between the do- mestic and imported ELISA kits for the detection of HFRS IgG antibody立即与 IgG 结合而无需长时间孵育，因此可以缩短实验时间13，且不易出现抗人 IgG 抗体长时间孵育 过程中出现的抗原抗体解离的问题； 但 SPA 除与项目检测原理 标记物 标本标本稀释倍数国产 ELISA 试剂盒ELISA 间接法HRP 标记 SPA血清、血浆、细胞培养上清41 倍进口 ELISA 试剂盒ELISA 间接法 HRP 标记抗人 IgG 血清201 倍IgG 结合外，还能与血清中少量的 IgM 和 IgA 结合。 鉴于此，SPA 现已广泛用于 ELISA 试剂盒的建立， 如国内已建立检测狂犬病病毒抗体的 SPA ELISA14孵育时间30 min45 min试剂 盒、 检 测 冠 状 病 毒 抗 体 的 SPA ELISA 试 剂底物 判定结果TMBP/N（标本 O.D 值/阴性对 照 O.D 值）2.1 为阳性， P/N1.5 为阴性TMBQ（标本 O.D 值/参照质 控 O.D 值）1.5 为阳性， Q1 为阴性盒15以及用于检测弓形虫抗体的 ELISA 试剂盒16等。分别用国产和进口同一批次 ELISA 试剂盒进 行精密性实验，计算检测结果的批内变异系数。 实注：HRP. 辣根过氧化物酶；SPA. 葡萄球菌 A 蛋白；TMB. 3,3,5, 5, -四甲基联苯胺接种效果监测具有重要意义10。 HFRS 抗体检测的 方法有多种，如间接免疫荧光、ELISA、胶体金法和 免疫组化法等。 ELISA 法因其灵敏、特异、简单、稳 定和易于自动化操作等特点，成为实验室检测病毒 感染和血清抗体的主要方法之一，也是临床检验科 检测 HFRS 的常用方法。 市面销售有多种国产和进 口 HFRS 抗体 ELISA 检测试剂盒，有必要对其检测 性能进行比较研究。 本研究比较上海西唐生物科技 有限公司和德国 IBL 公司原装进口的 HFRS 抗体 ELISA 检测试剂盒， 分别用 2 种试剂盒检测 50 份 HFRS 疫苗接种者血清标本的 HFRS IgG 抗体，一致 性比较结果显示二者的相似率为 60%。 2 种试剂盒 阳性检出率有明显差异，国产 ELISA 试剂盒阳性检 出 率 为 90% ， 进 口 ELISA 试剂盒阳性检出率为 50%。 将 HFRS IgG 抗体阳性血清连续进行倍比稀 释后进行 2 种试剂盒的灵敏度检测，结果表明国产 HFRS 试剂盒的灵敏度约是进口 HFRS 试剂盒的 5 倍。 2 种试剂盒结果判定标准不同，国产 HFRS 试 剂盒以 P/N（标本 O.D 值/阴性对照 O.D 值）2.1 为 阳性， 进口试剂盒以 Q （标本 O.D 值/参照质控 O.D 值）1.5 为阳性。 这些方法学的差异可能导致了国 产 ELISA 试剂盒与进口 ELISA 试剂盒的检出率和验结果表明国产和进口 ELISA 试剂盒的批内变异 系数均小于 5%，2 种试剂盒的精密度均较好，意味 着 2 种试剂盒检测的重复性好。胶体金层析技术作为一门成熟的实验诊断技 术， 近年来已被广泛应用于临床诊断和免疫抗体 的监测17-18，方法简便、快速、不受条件限制，很适 用于基层业务单位使用。 据报道用于检测 EHF IgG 抗体的胶体金法灵敏度和特异度分别为 94.9%和 100%19。 国产和进口 HFRS 抗体 ELISA 检测试剂盒 与胶体金法试剂盒的一致性比较显示：国产 ELISA 试剂盒与胶体金法试剂盒的相似率为 76%； 进口 ELISA 试剂盒与胶体金法试剂盒的相似率为 84%。 50 份血清样本中，胶体金法试剂盒的阳性检出率为66%，介于国产与进口 ELISA 试剂盒之间。 造成阳性检出率差异显著的主要因素是方法的灵敏性、试 验结果判定标准等。 据检测结果推测国产 ELISA 试 剂盒灵敏度高，进口 ELISA 试剂盒特异性强。 试剂 盒的阳性率和一致性的差异提示要根据不同目的 合理地选择试剂盒。 国产 ELISA 试剂盒灵敏，价格 较便宜，适用于筛选实验；进口 ELISA 试剂盒特异 性强，可用于确证实验；而胶体金法试剂盒操作简 单、检测速度快，可用于临床即时检测。综上所述，国产和进口 HFRS 抗体 ELISA 检测 试剂盒均使用双抗体夹心 ELISA 法，操作步骤基本 一致，精密度良好，但二者在所用的酶结合物、结果判断方法、灵敏性、特异性、一致性和价格等方面存 在较大差异，在实际使用过程中应根据具体实验目 的合理地进行选用。参考文献1 Li K, Li PY, Wu XA, et al. Induction of Hantaan virus-specific immune responses in C57BL/6 mice by immunization with a mod- ified recombinant adenovirus containing the chimeric gene, GcS0.7J. Int J Mol Med, 2013, 32(3):709-716.2 Krger DH, Sch觟nrich G, Klempa B. Human pathogenic hantavirus- es and prevention of infectionJ. Hum Vaccin, 2011, 7(6):685- 693.3 Zhang X, Chen HY, Zhu LY, et al. Comparison of Hantaan and Seoul viral infections among patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in Heilongjiang, ChinaJ. Scand J Infect Dis, 2011, 43(8): 632-641.4 Wang W, Wang MR, Lin XD, et al. Ongoing spillover of Hantaan and Gou hantaviruses from rodents is associated with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) in ChinaJ. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7(10):e2484.5 王平忠，白雪帆，张颖，等. HFRS 患者汉滩病毒核蛋白特异性 T细胞克隆及其靶细胞的建立J. 中华微生物学和免疫学杂志，2004，24(8):600-605.6 Xiao D, Wu K, Tan X, et al. The impact of the vaccination pro- gram for hemorrhagic fever with renal syndrome in Hu County, ChinaJ. Vaccine, 2014, 32(6):740-745.7 王敬军，魏战臻，魏菁，等. 陕西省肾综合征出血热疫区人群国产疫苗免疫远期效果分析J. 中华流行病学杂志，2012，33(3): 309-312.8 Ford PJ. Immunological techniques: ELISA, flow cytometry, andimmunohistochemistryJ. Methods Mol Biol, 2010, 666:327-343. 9 Rouet F, Deleplancque L, Mboumba BB, et al. Usefulness of afourth generation ELISA assay for the reliable identification ofHCV infection in HIV-positive adults from Gabon (Central Africa)J. PLoS One, 2015, 10(1):e0116975.10 龚震宇，侯娟，刘起勇，等. 19942010 年浙江自然疫源性疾病 高发区鼠类综合监测和肾综合征出血热疫苗防病效果研究J. 中华预防医学杂志，2012，46(10):908-911.11 夏小静，李书光，王金良，等. 猪链球菌抗体 GDH 重组蛋白 PPA- ELISA 检测方法的建立J. 中国兽医科学，2012，42(9):932-937. 12 逢少堃，梁浩，宋淑亮，等. 葡萄球菌蛋白 A 活性机制与现代应用J. 生命的化学，2008，28(6):748-751.13 吴璞强. 金黄色葡萄球菌蛋白 A 亲和配基的分子改造与应用D. 无锡：江南大学，2013.14 范晓娟. 犬、猫狂犬病病毒抗体检测方法的建立D. 北京: 中国 农业科学院，2010.15 周杰，廖玉学，陈忠，等. SPA-ELISA 检测棕果蝠血清冠状病毒 抗体的研究J. 南方医科大学学报，2008，28(5):736-738.16 刘佩梅，杨秀珍，吴增强. SPA-ELISA 检测弓形虫抗体诊断试 剂盒的研制J. 天津医科大学学报，2000，6(1):12-14.17 Gonzalez JM, Francis B, Burda S, et al. Development of a POC test for TB based on multiple immunodominant epitopes of M. tubercu losis specific cell-wall proteinsJ. PLoS One, 2014, 9(9):e106279.18 Du S, Lin H, Sui J, et al. Nano-gold capillary immunochromato- graphic assay for parvalbuminJ. Anal Bioanal Chem, 2014, 406 (26):6637-6646.19 吴守丽，严延生，李世清，等. 重组汉坦病毒核衣壳蛋白抗原用于胶体金标记免疫层析法检测肾综合征出血热抗体J. 中华 微生物学和免疫学杂志，2007，27（2）:192-197.（2015-02-09 收稿 2015-03-06 修回）（责任编委 貌盼勇 本文编辑 王 姝）!（上接第 78 页）phocytesJ. Lab Invest, 2000, 80(9):1361-1372.26 Renesto P, Samson L, Ogata H, et al. Identification of two putative rickettsial adhesins by proteomic analysisJ. Res Microbiol, 2006, 157(7):605-612.27 Vellaiswamy M, Kowalczewska M, Merhej V, et al. Characterization of rickettsial adhesin Adr2 belonging to a new group of adhesins in -proteobacteriaJ. Microb Pathog, 2011, 50(5):233-242.28 Qi Y, Xiong X, Wang X, et al. Proteome analysis and serological characterization of surface-exposed proteins of Rickettsia heilong- jiangensisJ. PLoS One, 2013, 8(7):e70440.29 Gong W, Wang P, Xiong X, et al. Enhanced protection against Rickettsia rickettsii infection in C3H/HeN mice by immunization with a combination of a recombinant adhesin rAdr2 and a proteinfragment rOmpB -4 derived from outer membrane protein BJ.Vaccine, 2015, 33(8):985-992.30 Gong W