高新技术产业发展与科技攻关计划——.doc

高新技术产业发展与科技攻关计划 高新技术产业发展与科技攻关计划科技攻关项目可行性研究报告提纲1.项目概述近年来由于氟喹诺酮类（FQNs）药物在临床及其他领域广泛应用，铜绿假单胞菌（PA）对FQNs类药物耐药日益严重。 研究FQNs的耐药机制，对临床合理用药、延长药物使用寿命及新药的研发有重要意义。 本研究测定了2种FQNs（莫西沙星MXLX，环丙沙星CPLX）对临床分离PA的防耐药突变浓度（MPC）,比较其防突变能力，对不同药物浓度筛选出的耐药突变体用聚合酶链反应（PCR）及DNA测序方法确定其耐药决定簇(QRDRs)的gyrA、parC突变位点和相应的氨基酸变化，采用外排泵抑制剂(苯丙氨酸精氨酸萘酞胺，PAN)筛选PA MexA-MexB-prM主动外排表型，研究PA MexA-MexB-prM外排泵的外膜蛋白OprM的表达及泵调节基因mexR突变情况,目的探讨不同药物浓度、不同化学结构的FQNs对耐药突变体耐药基因的影响,为优化抗菌药物治疗方案提供参考依据。 2.必要性、可行性和重大意义2.1必要性在抗生素时代，感染仍是人类健康的主要杀手，占全球人口死因的32.7%，其根本原因是耐药致病菌及菌种的不断增加，抗菌药物抑菌活性的逐渐下降。 作为医院感染的重要致病菌，PA对FQNs类药物耐药日益严重。 深入研究FQNs的耐药机制是探求有效的延长抗菌药物使用年限策略、提高难治性感染治疗成功率的有效途径和必要手段。 临床上对于PA感染的治疗策略不应该仅仅着眼于控制感染，在达到控制感染的同时还应该考虑到限制耐药突变株的选择性扩增，通过选择更理想的药物、调整剂量方案、联合用药以关闭或尽量缩小突变选择窗（MSW）,从而减少耐药突变菌株富集扩增的机率,减少耐药。 MPC理论为研究细菌耐药机制开辟了新领域,也对临床应用抗菌药物提出新的要求，不但具有预期的经济价值，亦具有重要的社会效益。 2.2可行性申请者王煜现任中国医科大学附属盛京医院急诊科副主任，副教授，医学博士，一直从事重症感染和病原微生物耐药机制的研究工作。 博士论文获xxScholarship Grantfor YoungFellows ofDeveloping Countriesfrom theAmerican ThoracicSociety Assemblyon CriticalCare。 论文大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中质粒AmpC内酰胺酶基因型的检测获辽宁省自然科学学术成果贰等奖。 以署名第一作者撰写与本项目有关的论文10余篇（其中1篇被SCI收录，1篇被MEDLINE收录，4篇被BA、CA收录）。 xx年获沈阳市科学技术计划项目一项（1063243-3-00），为第一负责人，现已结题。 参与国家自然基金和省教育厅高等学校科学技术研究项目多项。 项目组成员在硕士和博士研究生期间已熟练掌握了细菌培养、分离鉴定技术，质粒提取及纯化技术，PCR技术，分子克隆技术等分子生物学、生化和化学测定的实验技能。 如获得资助，可立即全方位展开研究工作。 本研究依托于中国医科大学呼吸疾病研究所。 呼吸疾病研究所是国家重点学科，科研人员力量雄厚，曾经承担并正在承担国家级，部级和省级重大科研课题多项。 下属中心实验室仪器设备齐全。 本项目所采用的实验技术和实验设备均不存在任何问题。 2.3重大意义近年来由于FQNs药物在临床及其他领域广泛应用，PA对FQNs类药物耐药日益严重，已成为今天临床抗感染治疗面临的极为严重的问题。 临床上对于PA感染的治疗策略不应该仅仅着眼于控制感染，在达到控制感染的同时还应该考虑到限制耐药突变株的选择性扩增，阻断第一步突变株的富集，减少耐药菌的出现。 本实验不仅从PA的体外试验测定MPC值，对不同药物浓度筛选出的耐药突变株靶位基因突变位点进行测定，而且对PA MexA-MexB-OprM外排泵的外膜蛋白OprM的表达及调控基因mexR突变情况进行检测。 通过对MPC理论的深入研究，将会对临床用药方案和药效与评价产生重大影响，并为解决日益严峻的临床耐药问题提供新的思路和方法。 3.国内外发展现状及趋势，市场需求分析3.1国内外发展现状及趋势在抗生素时代，感染仍是人类健康的主要杀手，其根本原因是耐药致病菌及菌种的不断增加，抗菌药物抑菌活性的逐渐下降。 铜绿假单胞菌(PA)是医院感染的重要致病菌1，近年来随着氟喹诺酮类（FQNs）抗生素的广泛应用,临床分离的PA对其耐药日趋严重。 研究细菌对FQNs类药物的耐药机制，阻断其耐药途径，对指导临床合理用药、延缓新一代FQNs的耐药性及延长其临床使用寿命以及研发新药均有重要意义。 1999年Drlica提出了防耐药突变浓度(mutant preventionconcentration，MPC)和突变选择窗(mutant selection window,MSW)的概念2。 通过对FQNs药物MPC的研究发现,随着琼脂平板中FQNs药物浓度逐渐增加,琼脂平板中细菌恢复生长的菌落数出现两次明显下降。 第一次下降发生在MIC99时,归因于药物抑制了大部分野生型药物敏感菌的生长；随着药物浓度增加,恢复生长的菌落数逐渐减少并维持在相对稳定的水平(平台期),其原因为药物敏感菌株被杀死或抑制,而选择出耐药突变菌株；随着药物浓度进一步增加,菌落数出现第二次明显下降,直至药物浓度增高到某一限度时琼脂平板中没有菌落生长,表明这一浓度阻断了最不敏感的、单步耐药突变菌株的生长,该浓度即为MPC。 MPC提供了抗菌药物治疗中严格限制突变菌株被选择性扩增的抗菌药物浓度阈值，用于评价抗菌药物抑制耐药突变菌株选择的能力。 MIC99与MPC之间的浓度范围为MSW，当治疗药物浓度落在MSW内，敏感菌被抑制或杀灭，耐药突变菌选择性富集，成为主要致病菌，从而产生耐药。 MSW理论与传统的药效学参数MIC有本质的区别3。 MIC的治疗策略着眼于“控制感染”,期望通过抗菌药物杀死或抑制敏感细菌,但有可能使治疗浓度落入MSW,导致耐药突变株的选择性富集。 MPC的治疗策略着眼于“限制耐药变异菌株的选择性富集扩增”,阻断第一步耐药突变从而防止耐药突变株的产生。 MPC和MSW理论为有效抑制细菌耐药及制定抗菌药物应用策略提供了新的思路，为新药的研发提出了新的要求。 PA对FQNs耐药的主要机制是靶位改变和主动外排增强。 PA的靶位改变主要集中在编码DNA促旋酶(gyrA和gyrB)和拓扑异构酶(ParC和ParE)上，对革兰阴性菌,gyrA基因的突变是FQNs对PA临床分离株的主要耐药机制,parC基因的突变只是使耐药性上升到更高水平4,5。 环丙沙星（CPLX）单纯抑制DNA促旋酶,而莫西沙星（MXLX）能够同时抑制DNA促旋酶和拓扑异构酶,所以其耐药性发展缓慢,呈低水平耐药,因为只有在致病菌中的二个靶酶的基因编码同时发生突变时才会导致耐药性的出现6。 PA对FQNs耐药的另一主要机制是主动外排增强。 主动外排系统作用底物广泛，能主动将扩散进细菌细胞的抗菌药物泵出细胞外，使细菌获得耐药性。 现在已确定的MexAB-oprM、MexCD一OprJ、MexEF一OprN、MexXY一oprM、MexGHI一OprM、MexVW一OprM和MexJK一oprM外排泵与细菌多重耐药有关。 由于MexAB-oprM系统能外排多种临床常用抗生素，如内酰胺类、FQNs、四环素类等，是近来研究最多最有临床意义的外排系统7，8。 MexAB一oprM系统由外膜蛋白oprM、膜融合蛋白MexA和内膜蛋白MexB三部分组成，三种蛋白的表达均受同一基因mexR的调控，mexR的突变可引起该系统的过度表达而使细菌产生耐药。 目前，关于MPC的研究国内刚刚起步，需要建立常用抗菌药治疗各种重要病原菌的MPC,但尚未见对PA的报道。 本研究测定了2种FQNs（MXLX，CPLX）对临床分离PA的MPC,比较其防突变能力，对不同药物浓度筛选出的耐药突变株用PCR及DNA测序方法确定耐其耐其耐药决定簇(QRDRs)的gyrA、parC突变位点和相应的氨基酸变化，采用外排泵抑制剂(苯丙氨酸精氨酸萘酞胺，PAN)筛选PA MexA-MexB-OprM主动外排表型，研究PA MexA-MexB-OprM外排泵的外膜蛋白OprM的表达及泵调节基因mexR突变情况,目的探讨不同药物浓度、不同化学结构的FQNs对耐药突变体耐药基因的影响,为优化抗菌药物治疗方案提供参考依据。 主要参考文献1.I?eri L,Bayraktar MR.Changes in the ratesof antimicrobialresistance amongclinical isolatesof Pseudomonasaeruginosa betweenxxandxxin atertiary-care teachinghospital inTurkey.New Microbiol，xx;31:351-355.2.Drlica K.The mutantselection concentrationand antimicrobialresistance.J AntimicrobChemother,xx;52:11-17.3.Croisier D,Etienne M,Berqoine,etal.Mutant selectionwindow inlevofloxacin andmoxifloxacin treatmentsof experimentalpneumocoal pneumoniain arabbit modelof humantherapy.Antimicrob AgentsChemother，xx;48:1699-17074.HooperD C.Becterial topiosomerase,anti topoisomerases andanti topoiserasesresistance.Clin InfectDis,1998;27(Suppl1):S54-S58.5.梁蓓蓓,王睿,柴栋.突变选择窗内筛选的大肠埃希菌耐药突变体靶位变异位点的研究.中国临床药理学杂志,xx;23:180-1836.Zinner SH,Lubenko IY,Gilbert D,etal.Emergence ofresistant Streptocouspneumoniae inan invitro dynamicmodel thatsimulates moxifloxacinconcentrations insideand outsidethe mutantselectionwindow:related changesin susceptibility,resistance frequencyand bacterialkilling.J AntimicrobChemother，xx;52:616-622.7.Aeschlimann JR.The roleof multidrugefflux pumpsintheantibiotic resistanceof Pseudomonasaeruginosa andother gram-negative bacteria.Insights from the Societyof InfectiousDiseases Pharma-cists.Pharmacotherapy，xx,23:916-924.8.Li Xian-zhi.Effiux-mediated Multipleantibiotic resistancein Pseudomonasaeruginosa.Chinese JournalAntibiotics，xx;28:578-581.3.2市场需求分析目前国内MPC的研究刚刚起步，缺乏常用抗菌药治疗对各种重要病原菌的“防突变浓度”范围的资料，铜绿假单胞菌的MPC研究尚未见报道。 本研究建立体外模型测定FQNs对PA的MPC和MSW,探讨不同药物浓度、不同化学结构的FQNs对耐药突变体耐药基因的影响,为抗生素的研发和合理应用提供新途径，具有广阔的市场应用前景。 4.基础和条件，与项目相关的前期工作情况4.1基础和条件申请者王煜，中国医科大学附属盛京医院急诊科副主任，副教授，医学博士。 毕业论文获xxScholarship Grantfor YoungFellows ofDeveloping CountriesfromtheAmerican ThoracicSociety Assemblyon CriticalCare和辽宁省自然科学学术成果贰等奖。 在读博士期间以细菌的耐药机制为主要研究方向，已熟练掌握细菌培养、分离鉴定技术，电转化技术，质粒提取及纯化技术，PCR技术，ELISA技术，分子克隆技术等。 以署名第一作者撰写与本项目有关的论文10余篇。 xx年获沈阳市科学技术计划项目一项，为第一负责人。 参与国家自然基金和省教育厅高等学校科学技术研究项目多项。 项目组主要成员赵敏教授，中国医科大学附属盛京医院急诊科主任医师，博士生导师。 现任中华医学会急诊分会常委，辽宁省急诊分会副主任委员。 现承担国家自然科学基金项目一项，辽宁省教育厅高等学校科学研究项目一项，沈阳市科学技术计划项目两项，累计基金58余万元。 以署名第一作者发表在国家级杂志论文20多篇。 中国医科大学是一所集教学科研于一体的综合性大学，其下属的呼吸疾病研究所是国家重点学科点，每年国家及校院都投入一定资金支持科研工作和实验室建设。 目前呼吸所实验中心占地面积500m2，万元以上仪器38件。 设有肺功生理、免疫微生物、生化、分子医学、病理及临床药理等九个实验室。 主要仪器设备有高效液相色谱仪，电脑压力蒸汽灭菌器，荧光显微镜，倒置相差显微镜，超低温冰箱，CO2细胞培养箱，微量电子天平，酶标仪，DNA扩增仪，水平与垂直电泳仪，LKB2117等电聚焦系统，UVP凝胶成像及分析系统，电热恒温培养箱，空气振荡培养箱，超净工作台，低温高速台式离心机，小型三用水箱，紫外分光光度计，流式细胞仪，电穿孔仪等。 此外，长期与校卫生部细胞生物重点实验室及院中心实验室密切合作研究。 呼吸所实验中心具有独立承担本项目的大多数实验仪器设备，再有校院中心实验室配合，确保本课题的完成。 4.2相关前期工作情况申请人一直从事重症感染和病原微生物耐药机制的研究工作，致力于把握该领域的热点和难点，先后完成了革兰氏阴性杆菌中超广谱内酰胺酶、AmpC酶表型和基因型的检测工作,撰写相关论文10余篇已在核心杂志上发表。 项目组成员在硕士和博士研究生期间已熟练掌握了细菌培养、分离鉴定技术，质粒提取及纯化技术，PCR技术，分子克隆技术等分子生物学、生化和化学测定的实验技能。 申报的课题是前期研究工作的延续和深化，申请人有充足的时间、较强的科研能力和严谨的科研态度，确保研究工作的顺利进行。 5.总体目标、考核指标、主要研究内容、实施进度安排5.1总体目标1)测定两种FQNs药物（MXLX、CPLX）对PA的MPC，比较其防耐药突变能力，了解突变耐药菌对FQNs的耐药性；2)研究不同药物浓度、不同化学结构的FQNs药物对MSW内筛选的PA耐药突变体的靶位基因的影响；3)研究PA耐药突变体MexA-MexB-OprM外排泵的外膜蛋白OprM的表达及泵调节基因mexR突变情况。 5.2考核指标1）两种FQNs药物对PA标准菌的菌落恢复生长比率曲线的绘制。 2）对不同药物浓度筛选出的耐药突变株进行gyrA和parC基因的PCR扩增，PCR产物经克隆后测序，将所测序列与基因库颁布的序列进行比较。 3）PA外膜蛋白SDS-PAGE结果:对指示OprM蛋白的49kD处的各电泳条带进行光密度扫描,比较PA耐药株与敏感株OprM蛋白光密度值差异。 5.3主要研究内容1）测定MXLX、CPLX对PA的MPC和MIC，比较其防耐药突变能力；2）对不同药物浓度筛选出的耐药突变株进行gyrA和parC基因的PCR扩增和测序；3）PA耐药突变株MexA-MexB-OprM主动外排表型的筛选，并进行外排泵的外膜蛋白SDSPAGE分析,PCR扩增mexR基因,鉴定产物,测序。 5.4实施年限及进度安排xx年6月xx年12月收集标本，筛选菌株。 xx年1月xx年3月测定MXLX、CPLX对PA的MPC和MIC。 xx年4月xx年6月对不同药物浓度筛选出的耐药突变株进行gyrA和parC基因的PCR扩增和测序。 xx年7月xx年9月PA耐药突变株MexA-MexB-OprM主动外排表型的筛选。 xx年10月xx年12月PA耐药突变株MexA-MexB-OprM外排泵的外膜蛋白SDSPAGE分析,PCR扩增mexR基因,鉴定产物,测序。 xx年1月xx年6月结果的处理与统计分析，论文撰写，期刊投稿。 6技术创新点、关键技术内容6.1主要技术创新点1.目前国内MPC的研究刚刚起步，缺乏常用抗菌药治疗对各种重要病原菌的“防突变浓度”范围的资料，MPC的研究主要集中在结核分支杆菌、包皮垢分支杆菌、肺炎球菌和金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌的MPC研究尚未见报道。 本研究建立体外模型测定FQNs对PA的MPC和MSW,探讨不同药物浓度、不同化学结构的FQNs对耐药突变体耐药基因的影响,为临床合理和优化使用抗生素提供新的思路。 2.国内关于临床分离PA耐药株MexA-MexB-OprM外排泵的外膜蛋白OprM的表达及调控基因mexR突变情况的研究鲜有报道。 目前仍缺乏有效的工具直接评估药物泵出,OprM又是MexA-MexB-OprM外排泵维持功能的必要成分,因此OprM表达可作为评价外排泵表达的有效指标。 SDS-PAGE是对蛋白质进行量化、比较及鉴定的一种经济、快速且可重复的方法，有条件进一步以免疫印迹法对外膜蛋白进行定性和半定量研究。 6.2研究的关键技术内容1)质粒载体的克隆用一种限制性酶切割质粒DNA,然后在体外与外源DNA连接，再用所得到的重组质粒转化细菌。 关键在于鉴定重组体，区分插入外源DNA质粒和无外源DNA插入而自身重新环化的载体分子是主要困难。 通过调整连接反应中外源DNA和载体的浓度，可以将载体的自身环化限制在一定程度之下。 2）为将OprM蛋白的表达量化,实验中在进行外膜蛋白SDS-PAGE之前,以紫外分光的方法测量了所提取的各菌株的外膜蛋白浓度,经过计算确保每份标本总的外膜蛋白的上样量是相同的。 7实施的技术路线、工作路线7.1技术路线受试菌（14株临床分离对CPLX敏感PA和PA ATCC27853）7.2工作路线1）菌株14株对CPLX敏感的PA分离至我科医院感染的临床患者，菌种鉴定采用法国API20E鉴定系统，质控菌株铜绿假单胞杆菌ATCC27853由中国药品生物制品检定所提供。 2）MIC测定及MXLX、CPLX联合PAN对耐药突变株的MIC测定采用琼脂二倍稀释法测定MXLX和CPLX对临床分离PA及不同耐药突变株的MIC，在测定MIC的同时，制备含有外排泵泵抑制剂PAN的平板(PAN终浓度为20mg/L)，与PAN联用的FQNs的MIC比单用FQNs的MIC降低4倍说明有主动外排机制存在。 3）MPC的测定将MXLX和CPLX倍比稀释成不同的浓度，药液和MH琼脂培养基按19的比例在90mm的平板中混匀，配制成浓度高于MIC的系列浓度二倍稀释的含药平板，每个浓度4个平板，置37孵箱过夜。 单个菌落过夜培养后集菌，把菌液调至1010CFU/ml，取100l均匀地涂在制备好的含药平板上，孵育 24、48和72h后观察结果，以不出现细菌生长的最低药物浓度为该药对这种细菌的MPC值。 MPC测定及菌落恢复生长比率曲线的绘制耐药突变体筛选突变频率的测定MIC测定PCR扩增gyrA基因和parC基因及测序MXLX、CPLX联合PAN对耐药突变株MIC测定PA MexA-MexB-OprM外排泵外膜蛋白OprM的表达PCR扩增mexR基因及测序4）菌落恢复生长比率曲线的绘制按照第3步集菌方法集菌后，将1010CFU/ml的菌液倍比稀释成不同浓度至103CFU/ml，将不同浓度菌液100l涂在含抗菌药物平板上，计数恢复生长菌落数及恢复生长比率，描绘生长比率曲线。 5）MXLX和CPLX对ATCC27853耐药突变株的选择及其基因组DNA的提取按照第3步方法集菌后，将100l的菌液接种于含2MICMPC不同浓度的抗菌药物平皿上，37培养4872h，挑取不同浓度平板上生长的菌落，将这些菌落培养2代后接种于原药物浓度的平板上如仍然生长即为耐药突变株， 1、2步耐药突变株均按照此方法选择。 筛选出的耐药突变株用碱裂解法提取基因组DNA，做为PCR的DNA模板。 6）耐药突变株gyrA基因和parC基因的扩增及测序使用Primer5.0设计引物，gyrA正向引物为5TGCGAGAGAAATTACACC3，反向引物为5AATATGTTCCATCAGCCC3扩增片段长度为625bp；parC正向引物为5CCAGCGTCGCATCGTCTA3，反向引物为5AAAGTTTGGCACCCAGTCG3，扩增片段长度为319bp。 扩增条件反应体系为50l，94预变性3min，循环参数为变性9430s，退火gyrA为5030s，parC为5430s，延伸gyrA为7230s，parC为7230s，35个循环，72延伸10min。 扩增产物经含EB的1%琼脂糖凝胶电泳后照像。 PCR产物按照产物纯化试剂盒纯化后委托上海生工公司测序。 7）外膜蛋白提取及SDS-PAGE分析外膜蛋白提取参照文献方法进行。 所得产物以紫外分光法测定总外膜蛋白浓度。 外膜蛋白SDS-PA GE方法参照文献加以改进。 浓缩胶和分离胶浓度分别为3%和10%。 实验中根据所测外膜蛋白浓度计算上样量,保持总量一致。 采用考马斯亮蓝R250染色。 对电泳结果进行光密度扫描,对相对分子量49kD处的各电泳条带的宽度、亮度和面积进行分析、统计,计算并记录光密度值。 8）mexR基因检测上游引物为5ACCAATGAACTACCCCGTGA3,下游引物为5AATGTTCTTAAATA TCCTCAA3。 扩增mexR基因编码区,目的片段为436bp。 反应体系含10mmol/L Tris-HCl,50mmol/LKCl,2.5mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP,上、下游引物分别各50pmol/L,DNA模板各2L,Taq酶2.5U,总反应体系100L。 空白对照作为阴性对照。 反应条