miR-34a通过Notch1信号通路对肺癌干细胞的抑制.doc

www.CRTER.org韩纪昌，等. miR-34a通过Notch1信号通路对肺癌干细胞的抑制miR-34a通过Notch1信号通路对肺癌干细胞的抑制韩纪昌，张祎捷，李红兵，杨存葆，马超楠，戚冠斌(河南大学淮河医院呼吸内科，河南省开封市 475000)引用本文：韩纪昌，张祎捷，李红兵，杨存葆，马超楠，戚冠斌. miR-34a通过Notch1信号通路对肺癌干细胞的抑制J.中国组织工程研究，2016，20(23):3349-3356.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.001 ORCID: 0000-0001-8450-019X(张祎捷)文章快速阅读：miR-34a及Notch1在肺癌干细胞增殖和凋亡中的作用韩纪昌，男，1977年生，山东省莒南县人，汉族，2004年广东医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事肺癌相关研究。通讯作者：张祎捷，硕士生导师，主任医师，河南大学淮河医院呼吸内科，河南省开封市475000中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)23-03349-08稿件接受：2016-04-19人肺腺癌细胞株A549细胞的培养免疫磁珠分选技术CD133+肺癌干细胞过表过miR-34a基因敲除Notch1流式细胞仪检测细胞凋亡MTT检测细胞增殖miR-34a通过Notch1信号通路影响肺癌干细胞增殖和凋亡双荧光素酶报告基因检测miR-34a与Notch1的靶向关系Western blot检验Notch1蛋白表达 文题释义：微小RNA：microRNA(miRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度一般为18-25个核苷酸。成熟的微小RNA可以与靶mRNA的3端非翻译区特异性结合，促使靶蛋白mRNA降解或抑制其翻译，最终使内源基因表达得到调控。miRNA广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡等过程的调节，几乎所有恶性肿瘤发生过程中都存在miRNA的异常表达。Notch信号通路：Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物，在进化上高度保守，通过相邻细胞之间的相互作用调节细胞、组织、器官的分化和发育。该通路由Notch受体、Notch配体、CSL-DNA、其他的效应物和Notch的调节分子等组成。Notch信号通路的激活是多种癌症发生的重要因素，并调控多种肿瘤干细胞的自我更新及存活过程。摘要背景：已有报道证实miR-34a对肺癌干细胞有一定的抑制作用，但是其作用机制目前还不清楚。目的：探索miR-34a对肺癌干细胞的抑制作用及机制。方法：应用免疫磁珠分选细胞技术从肺腺癌A549细胞系中分离出CD133+肺癌干细胞；脂质体转染技术构建miR-34a过表达的肺癌干细胞；双荧光素酶报告基因分析miR-34a与Notch1的靶向关系；基因敲除Notch1并检测其对肺癌干细胞的影响。结果与结论：经过免疫磁珠分选和流式细胞术检测得到高比率的CD133+肺癌干细胞；qRT-PCR检测发现miR-34a在CD133+肺癌干细胞中的表达明显低于CD133-肺癌细胞；成功构建miR-34a过表达的肺癌干细胞，发现miR-34a能够抑制肺癌干细胞的增殖，诱导细胞凋亡；双荧光素酶报告基因分析证明Notch1与miR-34a具有靶向关系；基因敲除Notch1显著抑制肺癌干细胞的增殖，诱导细胞凋亡；结果提示，miR-34a可能通过抑制Notch1信号通路来抑制肺癌干细胞的生长。关键词：干细胞；肿瘤干细胞；肺癌干细胞；miRNA；miR-34a；Notch1信号通路；Notch1；肺腺癌A549细胞；CD133+肺癌干细胞；增殖；凋亡主题词：肺肿瘤；肿瘤干细胞；微RNAs；受体, Notch1；组织工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 基金资助：河南省卫生厅中青年科技创新人才工程(4189号)Inhibitory effect of miR-34a on lung cancer stem cells via Notch1 signaling pathwayHan Ji-chang, Zhang Yi-jie, Li Hong-bing, Yang Cun-bao, Ma Chao-nan, Qi Guan-bin (Department of Respiratory Medicine, Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, Henan Province, China)AbstractBACKGROUND: It has been proved that miR-34a plays an inhibitory role in the growth of lung cancer stem cells, but the underlying mechanism remains unclear.OBJECTIVE: To explore the inhibitory effect of miR-34a on lung cancer stem cells and the underlying mechanism. METHODS: The CD133+ lung cancer stem cells were separated from lung cancer A549 cell lines using magnetic activated cell sorting method. And miR-34a-overexpressing CD133+ lung cancer stem cells were established by liposome transfection technology. Besides, the targeted relationship between miR-34a and Notch1 was analyzed by the dual-luciferase reporter. Afterwards, Notch1 silencing was performed by gene knockout, and its effect on lung cancer stem cells was determined.RESULTS AND CONCLUSION: After sorted and detected by immunomagetic selection and flow cytometry assay respectively, a high rate of CD133+ lung cancer stem cell was obtained. And qRT-PCR detected that the expression level of miR-34a in CD133+ lung cancer stem cells was significantly lower than that in CD133- lung cancer stem cells. Moreover, miR-34a-overexpressing CD133+ lung cancer stem cells were successfully constructed and miR-34a significantly inhibited proliferation and induced apoptosis of lung cancer stem cells. Dual-luciferase reporter assay indicated that Notch1 mRNA was a target of miR-34a. In addition, Notch1 silencing obviously inhibited proliferation and induced apoptosis of lung cancer stem cells. These findings suggest that miR-34a can inhibite lung cancer stem cells via the Notch1 signaling pathway.Subject headings: Lung Neoplasms; Neoplastic Stem Cells; MicroRNAs; Receptors, Notch1; Tissue EngineeringFunding: the Science and Technology Innovation Project of Henan Provincial Health Department for Young Talents, No. 4189Cite this article: Han JC, Zhang YJ, Li HB, Yang CB, Ma CN, Qi GB. Inhibitory effect of miR-34a on lung cancer stem cells via Notch1 signaling pathway. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(23):3349-3356.Han Ji-chang, Master, Associate chief physician, Department of Respiratory Medicine, Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, Henan Province, ChinaCorresponding author: Zhang Yi-jie, Masters supervisor, Chief physician, Department of Respiratory Medicine, Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, Henan Province, China3353ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction肺癌是威胁人类健康的第一大恶性肿瘤，其死亡率占恶性肿瘤的首位，且呈逐年上升趋势1。虽然其治疗方案在不断更新及改进，但仍然无法有效改善患者的预后，5年生存率仍低于15%2。肿瘤干细胞是具有自我更新及无限增殖能力，存在于肿瘤细胞中的一个亚群，被认为是肿瘤放化疗后复发的根源3。2008年，Eramo等4首次利用CD133对肺癌细胞进行分选，CD133+细胞具有干细胞特性，CD133-细胞为非干细胞。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度一般为18-25个核苷酸。成熟的微小RNA可以与靶mRNA的3端非翻译区(3-untranslated region，3-UTR)特异性结合，促使靶蛋白mRNA降解或抑制其翻译，最终使内源基因表达得到调控5。miRNA广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡等过程的调节6-7。大量研究证实miRNA在几乎所有恶性肿瘤发生中都存在异常表达8。miR-34a属于抑癌miRNA，可以通过抑制癌基因的表达，调节细胞周期素(cyclins)和细胞依赖性激酶(CDKs)阻滞细胞周期，抑制肿瘤细胞的侵袭与转移，调节细胞自噬、肿瘤代谢、细胞衰老、药物敏感性等方式来抑制肿瘤的发生9-10。已有报道发现miR-34a在前列腺癌干细胞、乳腺癌干细胞、胰腺癌干细胞等多种肿瘤干细胞中发挥着重要的调节作用11-15。miR-34a对肺癌干细胞的抑制作用亦有文献报道，但是其作用机制目前还不清楚，需要进一步的研究和探讨16。Notch信号通路在进化上高度保守，在胚胎发育、器官成熟及肿瘤发生等过程中对细胞命运发挥着重要的调控作用17。Notch信号通路在多种肿瘤干细胞的自我更新及存活过程中参与调控。如敲除Notch1能够明显抑制乳腺癌干细胞数量及成瘤作用，在前列腺癌干细胞中Notch1的表达显著高于前列腺癌非干细胞，抑制Notch信号通路可以抑制白血病肿瘤干细胞的生长18-20。在肺癌干细胞的研究中发现，Notch信号通路可以鉴定干细胞样肺癌细胞，抑制此信号通路可以降低肺胰腺癌干细胞活性21-22。生物信息学显示Notch1是miR-34a的靶基因之一。有报道发现，在前列腺癌中，miR-34a过表达可以通过抑制Notch1的表达而抑制肿瘤23。还有研究报道miR-34a/Notch1通路在乳腺癌干细胞的调控中发挥着重要的作用14，提示了miR-34a在肺癌干细胞调控中可能的作用机制。实验采用免疫磁珠分选法从肺腺癌A549细胞系中分选出CD133+细胞，采用转染miR-34a模拟物的方法，观察miR-34a对肺癌干细胞的作用。为了阐明miR-34a对肺癌干细胞的作用机制，实验又使用Western blot及qRT-PCR技术检测上调miR-34a后Notch1的表达情况，采用双荧光素酶报告基因分析法验证了Notch1与miR-34a的靶向关系，并基因敲除Notch1检测其对肺癌干细胞的影响。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2015年10月在河南大学淮河医院病理实验室完成。 1.3 材料 人肺腺癌A549细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。miR-34a模拟物及miRNA模拟物对照购自美国ABI公司。主要试剂及仪器：RIPA蛋白裂解液(碧云天生物技术研究所)；TRIZOL试剂、Lipofectamine 2000转染试剂盒(美国Invitrogen)；Notch1兔抗人多克隆抗体(英国Abcam)；HRP标记羊抗兔二抗(美国Santa Cruz)；CD133-PE抗体、CD133免疫磁珠(德国Miltenyi)；DMEM/F12培养基(美国Gibco)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京世纪康为有限公司)；SYBR PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒(日本Takara)；Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(美国GeneCopoeia)；双荧光酶报告系统检测试剂盒(美国Promega)；Mx 3000P荧光定量PCR仪(美国Stratagene)；Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(美国Thermo)；流式细胞仪(美国BD)；荧光报告系统检测仪(美国Promega)；PCR基因扩增仪(德国Eppendorf)；纯水系统(美国Millipore)。1.4 实验方法1.4.1 细胞培养 人肺腺癌A549细胞系接种于含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM/F12培养基，置于37 、体积分数为5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2 d或3 d更换新鲜培养液。取对数生长期的细胞，加入0.25%胰酶(含EDTA)消化细胞并制成单细胞悬液，离心后重悬细胞，按照13的比例将细胞接种于含有2% B27、20 g/L表皮生长因子、20 g/L碱性成纤维细胞生长因子、无血清DMEM/ F12培养液的培养瓶中，放入CO2培养箱中继续培养传代。1.4.2 免疫磁珠分选CD133+肺癌干细胞 将第3代A549细胞培养于无血清培养液中，调整细胞浓度至21010 L-1，加入CD133抗体10 g，4 孵育20 min，清洗重悬细胞，再加入40 L IgG免疫磁珠，待充分结合后，再清洗重悬细胞，进入分选柱分选，吸附在分选柱中的细胞为CD133+细胞，流出的为CD133-细胞。1.4.3 流式细胞仪检测CD133+细胞比例 将分选前及分选后的细胞用PBS调整细胞浓度为1109 L-1，分别加入CD133-PE抗体20 L混匀，室温避光反应20 min，PBS清洗，用40 g/L多聚甲醛重悬后进入流式细胞仪检测。1.4.4 qRT-PCR 检测转录水平基因的表达 RNA的提取依照Trizol试剂使用说明书进行，再使用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计检测提取到的RNA的浓度和纯度。反转录及Real-time PCR过程均按照SYBR PrimeScript RT-PCR说明书进行，结果以2-Ct法分析。miR-34a的引物为：5-CGT CAC CTC TTA GGC TTG GA-3和5-CAT TGG TGT CGT TGT GCT CT-3；Notch1的引物为：5-GCA GTT GTG CTC CTG AAG AA-3和 5-CGG GCG GCC AGA AAC-3。1.4.5 细胞转染 按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书，以每孔(6.0-7.0)105的数量将对数生长期细胞平铺于6孔板中，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行转染miR-34a模拟物或miRNA模拟物对照，si-Notch1及si-control转染到细胞中，轻柔摇匀，于37 ，体积分数为5% CO2环境中培养，共得到转染miR-34a模拟物及miRNA模拟物对照两组细胞。细胞连续培养 48 h后可用于后续实验。1.4.6 MTT法检测细胞增殖 转染miR-34a模拟物及miRNA模拟物对照的细胞培养48 h后，每天进行MTT检测以观察细胞的活性，共观察5次。检测方法为：以0.25%胰酶将细胞进行消化并计数，以1108 L-1的细胞浓度接种于96孔板中，每孔加入MTT (1 g/L) 50 L，孵育4 h后，再加入200 L二甲基亚砜，振荡混匀10 min，用酶标仪检测470 nm波长处吸光度值。1.4.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 将转染48 h后的miR-34a模拟物及miRNA模拟物对照细胞用0.25%胰酶消化，PBS清洗后加入250 L结合缓冲液使细胞重悬，再加Annexin V FITC溶液及PI染液各5 L，使其终质量浓度分别为1.0 mg/L，避光处孵育30 min后进入流式细胞仪进行检测，计算细胞的凋亡率。1.4.8 双荧光素酶报告基因分析 含有miR-34a结合位点的Notch1 3UTR克隆到荧光素酶报告基因载体pLUC中得到pLUC-Notch1-WT-3UTR质粒(WT-3UTR)。将含有miR-34a突变型结合位点的Notch1 3UTR克隆到荧光素酶报告基因载体pLUC中得到pLUC-Notch1-MUT- 3UTR质粒(MUT-3UTR)。miR-34a结合位点序列设计：miR-34a为CUG UGA CGG U，WT-3UTR为AAC ACT GCC T，MUT-3UTR为AAG CGC ATC T。严格按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书将miR-34a模拟物或miRNA模拟物对照与构建好的质粒(WT-3UTR或MUT-3UTR)分别共转染到肺癌干细胞中。细胞转染48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。使用裂解液充分裂解，以萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶显色，各组测定结果为萤火虫荧光素酶荧光值/海肾荧光素酶荧光值。1.4.9 Western blot检测Notch1蛋白表达 使用RIPA裂解液提取细胞中的总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各组蛋白浓度。各组加入上样缓冲液煮沸5 min取50 g蛋白上样做SDS-PAGE电泳。以含5%脱脂奶粉TBST抗体稀释液稀释Notch1及GAPDH一抗，4 过夜，PBS清洗，再加入HRP标记羊抗兔二抗，37 孵育2 h，用成像系统扫描并分析。1.5 主要观察指标 miR-34a在CD133+和CD133-细胞中的表达差异。转染miR-34a模拟物对肺癌干细胞增殖、凋亡及Notch1蛋白表达的影响。双荧光素酶报告基因检测miR-34a与Notch1的靶向关系。基因敲除Notch1对肺癌干细胞的影响。1.6 统计学分析 实验数据以s的方式表示，组间比较用t 检验或单因素方差分析，P 0.05为差异有显著性意义。采用SPSS 13.0软件分析统计数据。2 结果 Results 2.1 免疫磁珠细胞分选结果 采用免疫磁珠细胞分选技术在肺腺癌A549细胞系中分离CD133+肿瘤干细胞，流式细胞仪检测了分选前后CD133+细胞比例。分选前CD133+细胞的比例为1.3%，分选后CD133+细胞比例为92%。分选前后细胞比例差异有非常显著性意义(P 0.001)，见图1。CD133+细胞所占比例150100500a分选前 分选后图1 分选前后CD133+细胞所占比例Figure 1 Percentage of CD133+ lung cancer stem cells before and after magnetic activated cell sorting图注：经过免疫磁珠分选后CD133+细胞比例显著增加。与分选前相比，aP 0.001。2.2 miR-34a在肺癌干细胞中的表达 采用qRT-PCR技术检测免疫磁珠分选出来的CD133+细胞中miR-34a表达情况，以CD133-细胞为对照(图2)。结果显示，CD133+细胞中miR-34a的相对表达水平显著低于CD133-细胞(P 0.05)。1.51.00.50miR-34a的相对表达水平aCD133-细胞 CD133+细胞图2 miR-34a在CD133+和CD133-细胞中的相对表达水平Figure 2 Relative expression levels of miR-34a in CD133+ and CD133- lung cancer stem cells图注：与CD133-细胞相比，aP 0.05。2.3 转染后miR-34a在细胞中的表达 miR-34a模拟物及miRNA模拟物对照转染肺癌干细胞48 h后，qRT-PCR检测miR-34a的表达水平。由图3可见，miR-34a模拟物组miR-34a的表达水平明显高于miRNA模拟物对照组(P 0.001)。1086420amiR-34a的相对表达水平图3 miR-34a转染CD133+细胞后48 h的相对表达水平Figure 3 Relative expression level of miR-34a at 48 hours after transfected into CD133+ lung cancer stem cells图注：与miRNA模拟物对照细胞相比，aP 0.001。miRNA模拟物对照 miR-34a模拟物miRNA模拟物对照 miR-34a模拟物相对吸光度值5004003002001000PIaaAnnexin V FITC0 1 2 3 4细胞凋亡率(%)50403020100图5 miR-34a对肺癌干细胞凋亡的影响Figure 5 Effect of miR-34a on apoptosis of lung cancer stem cells图注：与miRNA模拟物对照相比，aP 0.01。amiRNA模拟物对照 miR-34a模拟物转染时间(d)图4 miR-34a对肺癌干细胞增殖的影响Figure 4 Effect of miR-34a on proliferation of lung cancer stem cells图注：与miRNA模拟物对照相比，aP 0.01。1.51.00.50Notch1 mRNA的相对表达水平Aa1.51.00.50相对荧光素酶活性miRNA模拟物对照 miR-34a模拟物miRNA模拟物对照 miR-34a模拟物aBNotch1GAPDHWT-3UTR MUT-3UTRmiRNA模拟物对照 miR-34a模拟物图7 双荧光素酶报告基因检测结果Figure 7 Results of dual-luciferase reporter assay图注：WT-3UTR和miR-34a模拟物共转染组的相对荧光素酶活性明显低于WT-3UTR和miRNA模拟物对照共转染组(aP 0.05)。图6 miR-34a对Notch1 mRNA和蛋白表达水平的影响Figure 6 Effect of miR-34a on mRNA and protein expression levels of Notch1图注：图中A为qRT-PCR检测Notch1 mRNA的表达水平；B为Western blot 检测Notch1蛋白水平。与miRNA模拟物对照组相比，aP 0.05。CB1.00.20相对吸光度值2520151050a凋亡率(%)si-control si-Notch1AaNotch1GAPDHsi-control si-Notch1图8 基因敲除Notch1对肺癌干细胞的影响Figure 8 Effect of Notch1 silencing on lung cancer stem cells图注：图中A为基因敲除后Notch1的蛋白表达水平；B为MTT法检测基因敲除Notch1对肺癌干细胞增殖的影响；C为流式细胞仪检测基因敲除Notch1对肺癌干细胞凋亡的影响。与si-Control组相比，aP 0.05。si-control si-Notch12.4 miR-34a对细胞增殖的影响 为了验证miR-34a对肺癌干细胞增殖的作用，采用MTT法检测了过表达miR-34a对细胞增殖的影响。结果发现，转染了miR-34a模拟物的细胞增殖速度明显低于miRNA模拟物对照组细胞(P 0.01)，说明miR-34a对肺癌干细胞具有明显的抑制作用(图4)。2.5 miR-34a对细胞凋亡的影响 运用流式细胞术检测了过表达miR-34a对肺癌干细胞凋亡的影响。如图5所示，miR-34a模拟物组的凋亡率明显高于miRNA模拟物对照组(P 0.01)。2.6 miR-34a抑制Notch1表达 miR-34a模拟物及miRNA模拟物对照转染肺癌干细胞48 h后，用qRT-PCR方法检测各组细胞中Notch1 mRNA的表达水平(图6A)。结果显示，与对照组相比，miR-34a模拟物转染的细胞中Notch1 mRNA的表达水平明显降低(P 0.01)。又用Western blot检测Notch1蛋白水平的表达(图6B)。结果显示，与对照组相比，miR-34a模拟物转染的细胞中Notch1的表达水平明显降低(P 0.05)。2.7 双荧光素酶报告基因检测结果 WT-3UTR和miR-34a模拟物共转染组的相对荧光素酶活性明显低于miRNA模拟物对照共转染组(P 0.05)，见图7。结果说明miR-34a可以与Notch1 mRNA 3UTR的特定位点结合，Notch1可能是miR-34a的靶向基因。2.8 基因敲除Notch1对肺癌干细胞的影响 为了进一步检测Notch1与肺癌干细胞的增殖、凋亡的关系，首先利用基因敲除技术将肺癌干细胞中Notch1的基因进行敲除，图8A显示，基因敲除后干细胞中Notch1的表达显著降低。MTT法检测结果显示(图8B)，基因敲除后干细胞的增殖明显受到抑制(P 0.05)。流式细胞仪检测结果显示(图8C)，si-Notch1显著增加了肺癌干细胞的凋亡(P 0.05)。这些结果说明，基因敲除Notch1能够抑制肺癌干细胞的增殖，诱导细胞凋亡。3 讨论 Discussion肿瘤干细胞是恶性肿瘤中一小部分具有干细胞潜能的细胞群，能够自我更新、无限增殖和分化，这些细胞在维持肿瘤生长、促进肿瘤血管生成、调控肿瘤细胞扩增、侵袭和转移中起着决定性的作用24。目前已经在多种恶性肿瘤中发现了肿瘤干细胞的存在，如白血病、前列腺癌、胶质瘤、胃癌、乳腺癌等11, 13-14。在肺癌干细胞的研究中，肺癌干细胞与肿瘤的发生、肿瘤细胞的侵袭和转移、愈后复发、药物耐性都有密切的关系，如何根除肺癌干细胞及了解其生物学特征越来越受到人们的关注，逐步成为研究的热点4, 25。在实体瘤中，干细胞的检测主要是通过细胞表面特异性标记或者利用Hoechst33342染料外排特性26。研究发现，CD133可以作为非小细胞肺癌干细胞表面的特征性标志27。CD133+细胞的比例与非小细胞肺癌的侵袭、转移、扩散程度及耐药程度呈正相关，因此肿瘤干细胞是非小细胞肺癌难于治疗、复发转移的根源28。此次实验利用CD133做为细胞表面标记，成功地从A549肺腺癌系中分离了CD133+肺癌干细胞，经过流式细胞仪检测，纯度达到92%。miRNA是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度一般为18-25个核苷酸，能够与靶mRNA的3非编码区(3UTR)互补结合，降解mRNAs或者抑制mRNA的翻译，从而参与调控基因的表达29-30。miR-15和miR-16是首次被报道在肿瘤细胞中表达异常的miRNA，在B细胞性慢性淋巴细胞白血病中miR-15和miR-16的表达下降，其编码基因恰好位于细胞染色体13q14缺失的部位，这一发现提示了miRNA在肿瘤研究中的重要性31。随后，越来越多的研究证明miRNA可以作为生物学的标记并在肿瘤靶向治疗中发挥着重要的作用32。目前，在多种肿瘤中检测到了miRNA表达异常，而且miRNA对干细胞的自我更新、增殖和分化等过程也具有重要的调节作用，通过调控miRNA在肿瘤细胞或者肿瘤干细胞的表达可以为肿瘤的治疗提供一种新的思路33。目前关于miRNA与肿瘤的研究中，大多是在肿瘤细胞中加入miRNA的模拟物或抑制物从而改变目标miRNA在细胞中的含量，进一步观察miRNA对肿瘤细胞的影响。实验利用lipofectamine 2000转染试剂盒成功地将miR-34a模拟物转染到CD133+肺癌干细胞中。miR-34家族包括了miR-34a、miR-34b和miR-34c，经过p53的诱导，miR-34可以调控细胞凋亡、细胞周期的停滞、细胞衰老，在肿瘤的发生中也发挥着重要的调控作用34。miR-34a可以通过靶向抑制c-Met基因表达而抑制肝癌细胞的侵袭和转移，最终抑制肿瘤的生长35。miR-34a能够通过调控SIRT1的表达而促进结肠癌细胞的凋亡36。既往研究表明miR-34a对前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤干细胞有抑制作用11-14。miR-34a在胰腺癌干细胞中可以通过调节Bcl-2、Notch1/2、CDK6等表达与生物活性来抑制细胞的生长37。通过抑制CD44的表达，miR-34a抑制了前列腺癌干细胞的增殖和转移11。miR-34a在脑瘤和胶质瘤干细胞中也充当了肿瘤抑制剂的角色38。实验成功构建了miR-34a过表达的肺癌干细胞，结果证明高表达的miR-34a能够抑制肺癌干细胞的增殖、促进细胞凋亡。有研究报道，在乳腺癌干细胞中，敲除Notch1能够明显降低干细胞的成球能力，细胞数量明显减少，成瘤作用受到抑制，被Notch1抑制剂处理后的干细胞表现出明显的增殖、侵袭和迁移受阻19。在Notch1对前列腺癌干细胞影响的研究中发现，敲除Notch1会明显抑制ABCC1的表达，细胞对化疗药物的敏感性得到提高，染色质免疫沉淀技术检测发现Notch1能够与ABCC1的启动子区结合，Notch1对ABCC1的调控可能是前列腺癌干细胞产生耐药性的一个重要原因20。在小细胞肺癌细胞中，Notch信号通路可以导致细胞周期阻滞而抑制肿瘤的生长39。在Notch信号通路研究中发现，Notch1、DLL1、Jagged1都是miR-34a的靶基因，miR-34a可以通过抑制Notch1的表达来诱导肿瘤细胞凋亡及增加药物敏感性等40。实验用qTR-PCR和Western blot两种方法表明了在过表达miR-34a的肺癌干细胞中Notch1表达水平明显受到抑制，进一步使用双荧光素酶报告基因分析发现miR-34a可以与Notch1 mRNA 3-UTR的特定位点结合，证明了Notch1可能是miR-34a的靶向基因。基因敲除Notch1显著抑制肺癌干细胞的增殖，诱导细胞凋亡，提示miR-34a对肺癌干细胞增殖和凋亡的影响可能是通过Notch1实现的。综上所述，实验以CD133为肺癌干细胞的表面标记，采用免疫磁珠分选细胞技术，经过流式细胞术检测，成功从肺癌A549细胞系中分离出CD133+肺癌干细胞。采用脂质体转染成功构建了miR-34a过表达的肺癌干细胞，观察到miR-34a可以明显抑制干细胞的增殖和促进细胞凋亡。应用双荧光素酶报告基因分析进一步证明了Notch1可能是miR-34a的靶向基因，为肿瘤靶向治疗提供新的理论依据，为miR-34a、Notch1信号通路和肺癌干细胞的研究提供参考。作者贡献：韩纪昌、李红兵进行实验实施，杨存葆、马超楠、戚冠斌进行数据统计以及最终成文，张祎捷进行实验设计、文章修改。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：没有与相关伦理道德冲突的内容。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：通讯作者对于研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Lortet-Tieulent J, Soerjomataram I, Ferlay J, et al. 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