亚健康小鼠实验模型.doc

疲劳型亚健康小鼠模型的研制 刘艳艳1 陈淑娟2 黄建华3 谭为1 欧阳明子1赵晓山1 罗仁1#1南方医科大学附属南方医院中医科（510515）；2广州军区总医院肾内科（510010）；3广州军区总医院呼吸内科（510010）摘要 目的 研制疲劳型亚健康小鼠模型。方法 实验一：每天强迫小鼠水中站立8h，分别观察连续造模5d、9d、12d、16d时小鼠行为学表现，以力竭游泳时间反映其疲劳程度，结合血浆生化、血常规及病理组织学检查等，确定造成疲劳型亚健康的最佳时间。实验二：对上述创建的疲劳型亚健康小鼠模型的评价，观察模型小鼠的疲劳持续时间。结果 实验一：模型各组游泳时间与正常组比较显著下降， P=0.000。血生化示，仅造模16d组与正常组小鼠在BUN、ALT、AST、TG水平上发生明显改变（0.05）。其余血生化、血常规及病理切片未见明显异常。实验二：模型小鼠力竭游泳时间明显下降；去除造模因素，休息恢复7d后其力竭游泳时间虽有增长，但与正常组仍有差异（P0.05）。结论 采用强迫小鼠水站立8h，连续9d，可成功制备疲劳型亚健康小鼠模型。模型评价表明该模型的稳定性、重复性较好。这为疲劳型亚健康病理机制的研究及相关药物的筛选提供了技术平台。关键词: 疲劳型亚健康 小鼠 动物模型A study of fatigue-type sub-health model on miceLiu Yan-yan1, Chen Shu-juan 2, Huang Jian-hua3, Tan Wei1, Ou Yang-ming-zi, Zhao Xiao-shan1, Luo Ren1#1Department of Traditional Chinese Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515; 2Department of nephrology, General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010; 3Department of Respiratory Medicine, General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010Abstract：Objective To establish and evaluate the fatigue-type sub-health model of mice. Methods Experiment 1: Mice in model groups were forced to stand in water 8 hours per day each for 5days, 9days, 12days and 16days. In the course of experiments, we analyzed the performances of mice behaviors, degree of fatigue, pathological signs in tissue, blood biochemistry results and other indicators, to determine the optimal time for this fatigue-type sub-health model. Experiment 2: On the basement of these above working, mice model of fatigue-type sub-health status was prepared. Then we observed their recovery in 7th, 14th day after their model, using the test of 7% weight-loaded forced swim. Results Experiment 1: In comparison with normal control group, the exhaustive swimming time was notably down among model of 5d, 9d, 12d, 16d groups (P=0.000). In terms of blood biochemistry results, the levels of BUN, ALT, AST, TG were different among model groups and its ascending or descending extend related with model time. The model 16d group is the only one which has the levels of BUN, ALT and AST were significantly different compared with normal control group (P0.05); Each group showed no abnormal changes in routine blood test and pathological lesions. Experiment 2: we found the swimming time of model mice decrease significantly, indicating an obvious fatigue of model mice. Although the fatigue degree abated after a rest of 7days free of modeling factors, swimming time was still less than normal level (P0.05). Conclusion We finally determined the way of forcing mice to stand in water 8 hours per day for 9 days can successfully establish this mice model of fatigue-type sub-health, and the evaluation of this model showed it well stability and reproducibility. This provides a technology platform on research of the pathological mechanism on fatigue-type sub-health and its drug treatment.Keywords: Fatigue-type sub-health; Mice; Animal model亚健康是现阶段影响我国公共卫生的重要问题。北京、广州等多地的大规模亚健康流调结果显示1-2，疲劳是亚健康状态的最主要表现之一，疲劳型亚健康是亚健康的主要类型 3。疲劳型亚健康是以长时间疲劳（即亚病理性疲劳或亚临床性疲劳）为中心表现的症状群，包括疲倦乏力、周身不适、失眠、多梦、头晕、反应适应能力下降等，但是上述表现不是由疾病引起来的。目前认为其发生主要与超负荷工作、心理压力大、熬夜、生活不规律等因素有关4-5。但其确切机制尚未明确，这在一定程度上妨碍疲劳型亚健康的有效预防及干预。理想的疲劳型亚健康动物模型的建立可为其发生机制的探讨及临床药物筛选奠定基础，但迄今尚未见有理想的疲劳型亚健康动物模型。本研究在既往研究的基础上6-7，拟采用强迫小鼠水中站立一定时间的造模方式进行造模，以模拟疲劳型亚健康身心疲劳、心理应激、生物节律紊乱的相关形成因素，并依据小鼠行为学表现、疲劳程度、生化及病理组织切片等指标，对疲劳型亚健康小鼠模型进行界定和优效性评价。1 材料与方法11主要仪器与试剂小鼠饲养盒 29cm18cm15cm（苏州新区枫桥实验动物笼具厂）；恒温游泳箱（直径75cm，高100cm）；eppendorf微量移液器；Olympas AU800全自动生化分析仪；负重用铅坠（自制）、秒表、电子天平、温度计。甲醛：分析纯，汕头市光华化学厂；无水乙醇：分析纯，汕头市光华化学厂。12实验动物与条件SPF级健康雄性KM小鼠260只（实验一：200只，实验二60只），体重1822g，由广东省医学动物实验中心提供，动物质量许可证号：SCXK（粤）2008-0002。实验前小鼠适应性饲养一周，室温2226 ，相对湿度40%60 %，明暗交替12 h。所有小鼠分盒饲养，5只/盒，自由饮水、采食。实验开始前小鼠适应性游泳锻炼4d，5min/d，水深30cm，水温25 。动物室保持安静，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。13实验方法1. 3. 1 实验一 疲劳型亚健康小鼠模型制备实验开始前1d，对小鼠进行负7%体重力竭游泳，记录游泳时间。实验前一天禁食，称重，剔除力竭游泳时间及体重差异较大的小鼠，筛选出KM小鼠150，随机分为15组：模型0d游泳组、模型5d力竭游泳组、模型9d力竭游泳组、模型12d力竭游泳组、模型16d力竭游泳组；正常0d力竭游泳组、正常5d力竭游泳组、正常9d力竭游泳组、正常12d力竭游泳组、正常16d力竭游泳组；模型5d生化组、模型9d生化组、模型12d生化组、模型16d生化组和正常生化组，每组10只，5只/盒。参照文献方法8，结合预实验结果，对模型各组采用强迫小鼠每天水中站立8小时的方式造模。具体方法：每日上午9：00，将模型各组小鼠放入水深为0.8cm的小鼠饲养盒内造模，当天下午 17：00，将其从水盒中拿出，正常饲养；正常对照组：不做任何处理，按常规饲养方法饲养。1. 3. 2 实验二 疲劳型亚健康小鼠模型的评价实验分组前处理同实验一。剔除力竭游泳时间及体重差异较大的小鼠，筛选出KM小鼠40只，随机分为4组：正常组、模型组、模型恢复7d组、模型恢复14d组。模型各组按预实验及实验一的结果，强迫小鼠每天水中站立8h，连续9d，制备疲劳型亚健康模型。造模结束后，即对模型组及正常组进行7%负重力竭游泳，测定其疲劳程度。模型恢复各组造模结束后，中止造模因素，分别于造模结束后7d、14d进行负重力竭游泳，观察其恢复情况。14 观测指标1.4.1 小鼠行为学观察 主要观察实验过程中小鼠的精神状态、活动情况、饮食、二便以及爪、鼻唇、耳等色泽等外观行为变化。1.4.2 疲劳程度测定：以力竭游泳时间测定小鼠疲劳程度。具体方法：用7%自身重量的铅坠系于小鼠尾部后，将负重小鼠放入水温25的水桶中进行力竭游泳测试；力竭游泳标准为小鼠鼻尖沉入水下10s 9。1.4.3 血浆生化 采用全自动生化分析仪检测小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、总胆红素（TBIL）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）,尿酸（UA）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、血糖（GLU）、甘油三脂（TG）、总胆固醇（Tch）、C-反应蛋白（CRP）、钾（K）、钠（Na）、氯（Cl）、钙（Ca）、镁（Mg）。1.2.2.3.4血常规 血常规分析仪检测小鼠白细胞总数（WBC）、淋巴细胞总数（LY）及百分比、中性粒细胞总数（GR）及百分比、单核细胞总数（MO）及百分比、红细胞总数(RBC)、血红蛋白(HB)、红细胞比容(Hct)、红细胞平均容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板总数(Plt)、血小板分布宽度(PDW)。1.2.2.3.5 病理学检查 实验各组小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠等主要脏器组织的病理检查。1.5 标本采集 分别于造模5d、9d、12d及16d后，对实验各组相应时间点生化组小鼠禁食，称重， 眼眶取血，分别装入生化及血常规管。室温放置30min后，1500r/min离心，上层血清移入EP管中，放入-20中保存待测。取小鼠心、肝、脾、肺、肾等器官组织，经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色。模型及正常力竭游泳各组不用禁食采血，仅在各自造模时间点结束的第二天，进行7%负重力竭游泳，测定其疲劳程度。16 统计方法利用SPSS13.0软件进行数据统计分析，具体分析方法包括析因设计方差分析和单因素方差分析，结果以均数标准差（ ）表示，P 0.05时存在统计学差异。2 结果2.1 实验一 疲劳型亚健康小鼠模型的制备2.1.1小鼠行为学观察实验第3d，造模各组小鼠未见明显异常，仅尾部皮毛有轻度浸湿；实验5d，烦躁，易激惹，撕咬，体重下降不明显，尾部浸湿面积增加；实验9d，小鼠烦躁消失，精神倦怠，全身皮毛有浸湿现象，浸湿面积在1/3到2/3之间，皮毛灰暗，欠光泽，逃避反应降低；实验12d时，精神不振，食量减少，体重下降，大部分小鼠全身浸湿；实验16d后精神倦怠明显，活动减少，全身皮毛浸湿，欠光泽整齐。正常对照各组，小鼠行为表现正常，无异常。2.1.2 疲劳程度变化造模小鼠力竭游泳时间随造模时间延长而明显减少，与正常组比较有统计学差异（P0.01），提示各造模小鼠明显疲劳。正常组各时间点力竭游泳时间比较无显著性差异（F=0.209，P=0.923）。见表1。表1 各组力竭游泳时间比值随着时间延长对照组和模型组的比较( )Tab1 Rate of exhaustive swimming time of experimental group and control group with experiment time( )组别例数正常对照组造模组合计FP0d组201.0000.1691.0000.138b1.0000.1500.0001.0005d组201.0280.1830.5940.122ab0.8110.268-6.2930.0009d组201.0110.1580.4720.184 ab0.7420.323-7.0220.00012d组201.0460.1680.3500.110ab0.6980.383-10.9920.00016d组200.9870.1240.2720.0825a0.6290.381-15.1760.000合计1001.0150.1560.5380.2880.7760.332263.0630.000F0.20947.22018.538F=19.562，P=0.000交互效应P0.9230.0000.000注：与0d组比较，a：P0.01与16d组比较，b：P0.01表示主效应的F值和P值2.1.3血生化结果血生化示，模型16d组BUN、ALT、AST水平显著升高，TG显著降低，与正常组比较统计学意义（0.05）。见表2。表2 各组小鼠肾功能BUN、ALT、AST及TG ( )Tab 2 BUN、ALT、AST、TG levels of mice in all groups( ）组别例数（n）BUN(mmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)TG(mmol/L)5d组107.4700.79625.2001.75170.6008.6311.0370.1209d组108.0400.71125.3001.76771.0006.1460.9740.12912d组108.3300.68526.9001.37077.3007.3940.8910.07816d组1012.0502.45030.1001.37091.7009.5690.7650. 051正常组107.4501.09725.1002.26069.00014.5451.0520.1378F21.09013.0979.34211.987P0.0000.0000.0000.000注：与正常组相比，：P0.012.1.4血常规及病理切片结果各组小鼠器官组织及血常规未见明显差异。2.2 实验二 疲劳型亚健康小鼠模型的评价2.2.1 小鼠行为学观察模型组小鼠精神倦怠，饮食尚可，体重略降，全身皮毛有浸湿现象，浸湿面积在1/3到2/3之间，皮毛灰暗欠光泽，逃避反应降低；造模中止，恢复7d后，小鼠精神较9d时有所好转，活动量增加，体重增加，但全身皮毛灰暗，欠光泽；模型恢复14d，小鼠精神活动正常自如，体重增加，体型饱满，全身皮毛光泽恢复。2.2.2疲劳程度变化与正常组比较，模型组小鼠力竭游泳时间显著下降（P0.05），提示模型小鼠明显疲劳；造模中止，恢复7后，小鼠力竭游泳时间较模型组增长，但与正常组比较仍显著性差异（P0.05）。见表3。表3小鼠力竭游泳时间比值比较（单位：s）（ ）Tab3 Compare the exhaustive swimming time between each group（ ）组别例数（n）力竭游泳时间百分比模型组100.5040.135模型恢复7d组100.6170.140模型恢复14d组100.9170.086正常对照组组101.0000.113F38.811P0.000注：与正常组比较，：P 0.053 讨论根据疲劳型亚健康的定义与特点，我们认为成功建立疲劳型亚健康动物模型应满足以下3个条件：它与人类疲劳型亚健康的发生原因相似；表现为以长时间疲劳为中心的症状群；各项检查未见明显异常，即不能确诊为疾病。目前文献报道中，常见的疲劳相关造模方式有悬吊、束缚、游泳、跑台、睡眠剥夺等单因素或复合因素造成实验动物的躯体或心理疲劳 10-12；此外通过将大鼠暴露在热环境内造成大鼠的热应激及躯体疲劳13；Gaab等通过对体内注射内毒素造成的免疫诱导性疲劳14等等。上述各种造模方式从单因素或者其他角度造成实验动物的慢性疲劳或慢性疲劳综合症（CFS）模型，但由于缺乏相应病理鉴定及评价，尚不能确定其是否为疲劳型亚健康的动物模型。由对于此，本课题组前期研究通过强迫大鼠负5体重力竭游泳复合剥夺睡眠20 h的造模方式，连续4 d，制备疲劳型亚健康大鼠模型15。该模型通过模拟疲劳型亚健康发生的相关因素（疲劳、睡眠不足、心理应激），造成模型大鼠的持续疲劳，同时又不导致大鼠器质性病理损害（即无疾病状态），一定程度上满足了制备理想疲劳型动物模型的条件，仍存在一定的问题： 负重力竭游泳可能会造成机体细胞结构的损伤。 该模型大鼠的疲劳状态持续时间较短并且容易恢复，可能达不到疲劳型亚健康的核心症状长时间疲劳的要求。为建立更为理想的疲劳型亚健康模型，我们经过大量的预实验研究，改良原有的疲劳型亚健康模型，选用动物实验中应用最广泛的小鼠为实验对象，采用强迫小鼠水中站立的这一相对缓和的造模方式，通过模拟亚健康形成的相关因素，建立小鼠的疲劳型亚健康模型。造模小鼠被放入一定水深的水盒中，为避免水沾湿身体，而保持站立姿势，并不断舔舐身体，造成小鼠躯体疲劳；利用小鼠对水的恐惧，造成其形成心理应激；利用小鼠夜间活动频繁，白天睡觉休息的特点，选在白天造模影响其正常睡眠质量及时间，干扰其正常的生物节律；采用5只一盒共同饲养及造模的方式，模拟人类正常社会工作、生活的环境，减少单只造模形成的孤立因素对模型的影响。该造模方式简单、方便易行，可重复性好，能更好地模拟人类亚健康状态，因而是一种较为理想的造模方式。根据疲劳型亚健康的特点，本实验以小鼠力竭游泳时间、外观行为学变化、血常规、血生化、病理组织切片等作为该疲劳型亚健康小鼠模型的评价指标，并注重观察造模后小鼠的疲劳恢复程度，对模型进行稳定性及有效性评价。本实验中，通过结合亚健康的特点及模型小鼠各项指标的变化，我们认为模型16d组血生化指标已发生改变，不应当属于亚健康状态的范畴。5d、9d、12d模型可以判定属于亚健康状态的范畴，但造模5d程度偏轻，12d程度偏重。为保持模型的稳定性，选择造模程度平稳适度的造模9d为最佳造模天数。以每天强迫小鼠水中站立8h的造模强度，连续造模9d，建立疲劳型亚健康小鼠模型。造模过程中，模型小鼠胃肠等病理切片未见异常，提示该造模方式较为缓和，并未造成实验小鼠的应激性溃疡。对该模型进行评价，发现造模后小鼠全身皮毛浸湿，灰暗，欠光泽，逃避反应降低，力竭游泳时间明显下降，造模停止后2周，其游泳时间尚可恢复正常状态，符合亚健康状态下疲劳持续时间较长但可以恢复的特点。总之，本研究确定通过强迫小鼠水中站立8h的造模方式，连续9d，可成功制备疲劳型亚健康小鼠模型。参考文献1. 霍云华, 王学良, 李俊,等.广东省某高校职工亚健康状态的临床表现调研分析J.南方医科大学学报, 2007, 27:448-449.2. 朱长刚,项平. 3324例快节奏人员亚健康状态调查及中医干预方药的探讨亚健康概述J.世界中医药, 2009, 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