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设计实验报展示生物大分子分离纯化及肝酶提取第一部分：生物大分子的分离与纯化技术首先要确认要分离的生物大分子是什么？核酸？蛋白质？多糖？脂类 ？其次根据不同生物大分子的特性制定不同的实验条件生物大分子分离纯化的特殊性生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。一、前期准备（一）、明确目的和要求（二）、了解的生物大分子的物学性质 1)在水和各种有机溶剂中的溶解性。 2)在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性 3)固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 4)各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数 5)其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。 6)对其他生物分子的特殊亲和力。（三）、生物材料的选择和前处理1、从工业角度考虑2、从科研角度考虑3、选材时，注意材料的季节性，动物的生理状态，微生物的生长期，选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。4、 材料选定以后要预处理（四）细胞破碎1、机械破碎法高速组织捣碎机 利用高速旋转的叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器 匀浆器用来破碎那些比较柔软，易于分散的组织细胞。科研上若材料处理量少，可使用匀浆器。研磨器 2物理破碎方法反复冻融法超声波破碎法 - 超声波多用于微生物细胞的破碎。3化学破碎方法：通过化学试剂的作用使细胞膜的透过性改变。4酶学破碎方法外加酶制剂自溶法 通过细胞本身存在的酶的作用使细胞壁自行破裂。 （五）细胞器的分离1离心技术：常速离心机；高速离心机；超速离心机；2分离细胞器的方法：差速离心法； 密度梯度离心； 等密度离心 （六）生物大分子的提取1、影响提取的因素主要有：目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；溶剂的pH值和提取时间等。通常：极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高，溶解度加大；远离等电点的pH值，溶解度增加。提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。2、提取方法： 水溶液提取：蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。 有机溶剂提取：一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。二、分离纯化（一）粗制品的分离方法1、蛋白质和酶粗制：盐析法，等电点沉淀法，有机溶剂分级分离法等。2、 RNA 和DNA的粗制：浓盐法、稀碱法、苯酚法等。3、 特点：简便，处理量大，既能除去杂质又能浓缩样品。4、缺点：分辨率低。 （二）精制品的分离纯化方法1、方法：离心、柱层析法、电泳法等。2、特点：规模小，分辨率高。 （三）结晶-物质呈晶状从溶液中析出的过程1、生化物质形成结晶的条件：（1）样品纯度 对于大多数蛋白质来说，一般要求纯度达50%以上才进行结晶。（2）溶液的饱和度（3）溶剂的选择三、生物大分子的浓缩，干燥和保存（一）、浓缩-从低浓度的溶液中除去水或溶剂使之变为高浓度的溶液的过程。 浓缩的方法：沉淀法蒸发浓缩吸收浓缩 超滤法 （二）干燥-把潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的水或溶剂除尽的过程。 干燥方法：真空干燥；冷冻真空干燥 （三）样品的保存1干粉保存：04 冰箱中保存即可（样品置于干燥器中）。2液态保存：04 冰箱即可。不能放在0 以下，因为结冰会使大分子构象破坏，使其失活。四、生物大分子含量的测定和纯化鉴定（一）、含量的测定1、测定多糖总量菲林试剂法，蒽酮法，旋光法等。2、测定蛋白质和酶总量凯氏定氮法，Folin-酚法，双缩脲法，紫外吸收法等。3、测定核酸总量定磷法、紫外吸收法。4、二苯胺法测DNA，地衣酚法测RNA。 （二）纯度鉴定1、蛋白质和酶制品纯度鉴定必须采用23种不同的鉴定方法才能确定。2、核酸的纯度鉴定从测A260/A280光吸收比值可判定样品的纯度。 RNA，A260/A2802以上，DNA，A260/A2801.8左右,若DNA的A260/A2801.8，说明制剂中存在RNA,需要考虑用RNA酶处理样品，提高DNA纯度。 第二部分：肝酶提取问题：设计从动物肝组织中分离、提取、纯化、和鉴定一种酶（该酶由不同的亚基组成，为结合酶，pI=6.2）的技术路线，并说明试验各步骤的原理。实验流程：取动物肝组织 . 制作组织浆液 肝酶的粗提取 肝酶纯化 活性检验 . 鉴定肝酶纯度1. 取动物肝组织：材料选择：选取新鲜的，饥饿24小时的动物的肝脏，生理盐水多次洗涤，低温保存。2. 制作组织浆液：取新鲜动物肝脏剪碎冰放进培养皿中，移入匀浆器，过滤梯度离心获得含有酶的细胞液：离心管中加入5ml 0.34M蔗糖，将5ml匀浆轻轻覆在 其上，1600r/min离心10min，得上清液（1） ：沉淀加10ml 0.25M蔗糖混匀，3500r/min离心10min， 得上清液（2）： 将上清液（1）（2）混合取1ml,6600r/min离心 10min，得上清液，即为酶体和微粒体3.肝酶的粗提原 理：中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面电荷和水化膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。（但沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度不同。例如，50饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33饱和的硫酸铵则使-球蛋白沉淀。）因此，可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。实验步骤：配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀 硫酸或氨水调PH到6.2 ，将酶溶液与硫酸铵溶液混合，静止一段时间 离心，去上清，留沉淀 ，加蒸馏水溶解，将溶液放入透析袋中透析，得含酶 的溶液。4.肝酶的纯化此实验主要用的是离子交换层析法：离子交换柱层析法实验原理：混合物在经过固定相和流动相的过程中，不断地 进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，由于其中各 组分间在理化性质上存在着差异，因此当它们经过上 述相同重复过程时，各自的情况就有会所不同，从而 使各物质得以分离。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素； CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素； DEAE纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子 交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质 被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度 办法将吸附的蛋白质洗脱下来。实验步骤：DEAE-纤维素处理为PH值为6.1（Hcl），装柱与平衡（乙酸铵溶液）， 样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或磺基水 杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，收 集第二个峰的蛋白溶液，处理DEAE-纤维素溶液为PH=6.3 ，装柱与平衡（乙酸铵溶液），样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含量为纵坐 标，收集管号为横坐标，收集第一个峰的酶溶液 即为PI=6.2左右的蛋白质溶液5.活性检验实验原理 结合酶的辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度 不同分为辅基和辅酶，辅基与酶蛋白共价键紧密结合， 透析超滤等物理方法不能除掉，辅酶与酶蛋白非共价 结合，较为疏松，透析和超滤等方法可以分离。实验步骤：若结合酶含有辅基，则直接加入底物，根据生成物的 性质进行生成物的鉴定。 若结合酶含有辅酶，则加入辅助因子（小分子有机化 合物和金属离子）然后再加入底物鉴定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶的分离纯度。6.鉴定肝酶纯度实验原理：Acr (丙烯酰胺) + Bis (交联剂N) 网状结构凝胶 引发剂过硫酸铵（Ap），催化剂四甲基乙二胺（TEMED） SDS(十二烷基磺酸钠:阴离子表面活性剂）能打断蛋白质的氢键和疏水 键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷 的量远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差 异。 SDS-PAGE常用来检测蛋白质样品的纯化程度，如果被 鉴定的蛋白质很纯，只含有一种三级结构的蛋白质或含 有相同分子量亚基的具有四级结构的蛋白质，那么SDSPAGE后就只出现一条蛋白质区带。 不连续凝胶电泳的支持体由分离胶和浓缩胶组成。上 层为浓缩胶，下层为分离胶，两层中Acr（丙烯酰胺） 浓度不同，孔径大小就不同，带电荷蛋白质离子在浓缩 胶中泳动时，因受阻力小，泳动速度较快。当泳动到小 孔径分离胶时，遇到阻力大，移动速度逐渐减慢，使样 品浓缩成很窄的区带。