乙型肝炎病毒耐药的一些基本概念.doc

慢性乙型肝炎（CHB）抗病毒治疗的地位和作用已经得到了确立，未来几年这一领域的发展方向就是新型NA的研发。随着对CHB抗病毒治疗临床研究的不断深入，在核苷（酸）类似物（NA）抗乙型肝炎病毒（HBV）治疗临床研究中发现HBV的耐药是一个普遍和突出的问题，只有充分重视HBV耐药的研究，才能更有效地贯彻长期抗病毒治疗的方针。一、乙型肝炎病毒耐药的一些基本概念HBV的基因耐药（genetic resistance）是指CHB患者血中的HBV基因序列出现了耐药相关的基因突变。如果检测到了HBV DNA耐药相关的基因序列，那么这种基因耐药肯定是存在的；如果检测结果阴性，却不能完全排除存在耐药基因变异病毒的可能性。在CHB患者血中检测到了耐药相关的基因突变，把变异的HBV DNA实现全基因克隆化，构建真核表达载体，体外转染肝癌细胞系，进行NA 的EC50/IC50的测定，如与野生株相比克隆的病毒株对药物的敏感性降低4倍以上，可确定为表型耐药（phenotypic resistance）。表型耐药是体外试验结果的一种描述。HBV DNA的反弹（rebound）或者称为突破（breakthrough）是指CHB患者在抗病毒治疗过程中，HBV DNA载量较最低水平上升1log10。ALT水平从正常值上限显著上升、或者在原来基础上出现ALT水平的显著升高，称为ALT波动（flare），这反映了由于病毒复制水平增加，导致肝脏炎症活动，表现为血清ALT水平升高。临床恶化（deterioration或exacerbation）是CHB患者因为病毒复制和肝脏炎症加剧，导致临床症状和体征的加剧或恶化。针对一种药物的耐药基因突变，同时对于另外一种无关的药物也出现耐药现象，称为交叉耐药（cross resistance）。交叉耐药产生是有其结构基础的，是交叉耐药相关药物耐药基因位点的接近或重叠造成的。二、乙型肝炎病毒耐药的一些基本理论为什么在抗病毒治疗过程中会出现耐药？主要原因是HBV自身复制能力很强，每24小时可以复制101213个拷贝，在复制的逆转录过程中，逆转录酶缺乏严格校正机制，自发突变率达10-5。HBV突变是绝对的，遗传是相对的。HBV感染的几十年中，积累了大量的基因序列突变的HBV病毒株，而有些病毒的基因变异恰好位于HBV DNA聚合酶的区域，就会产生耐药。以前认为，突变病毒株复制能力比野生型病毒复制能力有下降，但是目前认为HBV DNA突变对于病毒复制能力的影响是多种多样的：或降低其复制能力，或提高其复制能力，或没有影响。在没有NA抗病毒治疗的时候，各种病毒株在病毒群中所占的比例，主要由各种病毒复制能力等因素所决定。NA抗病毒治疗时，各种病毒因对药物敏感性不同，从而在病毒群中的相对比例就会开始出现差别。对于NA抗病毒治疗敏感的病毒株，因为受到选择性的压力其在病毒群中的绝对数和相对比例会逐渐减少，而耐药的病毒株绝对数影响不大，但相对比率逐渐上升。因此，经过抗病毒药物的选择，最终耐药病毒株从劣势种群逐渐演变成优势种群。在很多情况下，特别是感染了HBV很长时间的CHB患者，在血清中存在着各种各样的病毒株，只是比例不同。由于目前扩增HBV DNA序列的技术，都是依赖于PCR扩增技术，而PCR扩增技术是基于引物与模板之间的竞争性结合，因此，PCR阳性的结果，依赖于被扩增的模板在病毒群中所占的相对比例。简单说就是被扩增的特定病毒株必须在病毒群中的相对比例，必须达到最低的阈值。因此，基于PCR原理的HBV DNA扩增结果，如果获得了变异的病毒株，可以肯定变异病毒株的存在，但是，检测结果的阴性，则并不能完全排除变异病毒的存在，或许只存在少量的变异病毒，而没有达到其阈值，PCR扩增出现了假阴性而已。因此，对于HBV DNA检测结果必须有一个更为客观的认识。耐药研究提出了基因屏障（genetic barrier）和药代动力学屏障（pharmacodynamic barrier）的学说。不同的药物耐药的产生，决定于不同的基因序列的变异。如果只要出现一种或者一个位点的基因变异就产生耐药，就比同时出现多个为突变才产生耐药更容易一些，这就是所谓的基因屏障。因为NA抗病毒治疗对病毒复制抑制程度不同，而耐药病毒的产生，主要是因为药物抑制病毒复制的活性不彻底，如果一种药物对于无论野生型还是耐药病毒的复制能力都有很强的抑制作用，病毒的复制水平维持在很低的水平，产生耐药病毒的可能性就很小。这就是所谓的药代动力学屏障。药代动力学屏障的另外一层含义就是，早期抑制病毒的能力越强，产生耐药病毒的可能性就越小。这在所有的NA的临床研究中都是如此。将病毒的复制水平越早降低到检测不到的水平，耐药产生的可能性就越小。因此，临床上所应用的NA，抑制病毒的作用越强、越快，产生耐药的机会就越小。当然，这些因素不是产生耐药的全部决定因素，CHB患者临床耐药的产生是由病毒、机体免疫力、药物作用的特点等综合的因素来决定的。HBV准种特点的研究对于理解CHB患者临床耐药的形成过程和临床特点具有很大的帮助和意义。从准种特点来看，任何CHB患者血液中的HBV都是以不同种群存在的，种群的性质和特点，主要取决于病毒群不同组分的复制能力和机体的免疫力之间相互作用最终达到的一种平衡的结果。但是，开始应用NA进行抗病毒治疗时，这种平衡就被打破了，在药物选择的作用下，形成了新的平衡，各种病毒种群所占的相对比率也进行了新的调整。优势种群和不同的劣势种群存在着一种转换，称之为种群的的漂变（shift）。应用HBV准种的理论理解NA抗病毒治疗中的一些变化规律，非常有价值。三、乙型肝炎病毒耐药的处理原则自从1999年拉米夫定在中国上市，超过120万CHB患者曾经应用拉米夫定进行抗病毒治疗，目前拉米夫定耐药即YMDD结构域突变的耐药的临床处理是摆在我们面前的一项重要任务。拉米夫定耐药产生的比例随着治疗时间的延长而显著升高，15年的耐药率分别为20%、38%、49%、66%、69%。早期的研究表明，如果出现拉米夫定耐药，拉米夫定与阿德福韦酯重叠用药13个月后停用拉米夫定，与拉米夫定联合阿德福韦酯的临床疗效没有差别，但18个月以后，两药联合治疗的方案就显示出优势：更好的疗效，更低的针对阿德福韦酯的耐药。因此，更多的临床资料表明拉米夫定联合阿德福韦酯的方案对于长期抗病毒治疗来说可能更为合理。恩替卡韦抗病毒治疗，应该用1.0mg/日的治疗剂量。当然，针对拉米夫定耐药，也可以改用干扰素特别是聚乙二醇化干扰素治疗。将来可以选择其他的新型核苷类似物如泰诺福韦等。阿德福韦酯的耐药，主要是N236T或A181V的变异，因为与拉米夫定的YMDD位点没有重叠，因此，出现阿德福韦酯的耐药，应用拉米夫定是有效的。但拉米夫定对N236T突变株有效，对A181V突变株的敏感性下降。阿德福韦酯治疗5年的基因耐药、表型耐药和临床耐药的比率分别为29%、16%、11%，显著低于拉米夫定的耐药率。N236T耐药可选恩替卡韦或替比夫定治疗，而A181V突变对拉米夫定、恩替卡韦的敏感性有所下降，对泰诺福韦具有很好的敏感性。恩替卡韦临床应用时间尚短。初步临床结果表明，未经核苷类似物治疗的患者在恩替卡韦治疗96周后，较少有耐药的发生，拉米夫定耐药患者在恩替卡韦治疗48周后，大约7%的患者出现恩替卡韦的耐药。对于恩替卡韦耐药患者，加用或换用阿德福韦酯或泰诺福韦。针对多种NA的都耐药的所谓的多重耐药，随着NA的长期应用势必要出现。但是，针对多重耐药的处理原则还有待于进一步的临床研究。四、乙型肝炎病毒耐药研究存在的问题目前对于NA耐药的临床研究可谓刚刚开始，对于许多现象和规律的认识还很初步，需要进行大量的临床研究和实验研究。我们对HBV药物敏感性和耐药性的特点和产生规律的研究和认识也刚刚开始。也正因为如此，目前我们在CHB患者临床抗病毒治疗的药物选择方面还存在着很大的盲目性。我们还没有像指导临床抗生素应用的体外药敏实验系统，抗病毒药物的选择缺乏很好的循证医学的证据。对于病毒种群的认识、对于病毒耐药的认识，必将进一步推动这方面的进展。将来的发展方向，就是最大程度地了解病毒种群的性质，病毒种群对于不同药物敏感性的差别，病毒种群对于不同药物耐药的差别，并最终产生检测不同病毒种群的高通量技术，来指导抗病毒药物的选择。有了这样的客观的临床依据，必将促进抗病毒药物的正确选择，也必将会大幅度提高抗病毒治疗的疗效。 十年的核苷（酸）类似物抗HBV治疗的临床实践已证明口服核苷（酸）类似物的四种特性：“有效性”即在应用时可持续地抑制HBV复制；“易行性”即这类药物均口服，每天1片，简单方便；以及“安全性”，即不良反应少；但治疗过程中所出现的“耐药性”已成为影响其长期抗病毒治疗的最大“临床问题”之一。HBV临床耐药是当前核苷（酸）类抗HBV药物长期治疗所面对的主要问题。一旦耐药发生，可能伴随而来的是抗病毒药物的效力丧失，临床出现HBV载量上升，ALT上升，从而影响和改变患者的临床结局。具体表现为肝脏疾病进展，如肝炎复发、肝病急性加重、肝硬化，甚至肝衰竭、死亡等；对于肝移植患者，耐药将导致肝移植物发生排斥、肝移植失败。另外，耐药还可能给公共卫生带来极大的危害，核苷类似物耐药突变从理论上讲，可能导致HBsAg “a”决定簇发生变异，使现行乙型肝炎疫苗失去保护能力；同时也存在拉米夫定耐药乙型肝炎病毒株传播的可能，从而改变慢性乙型肝炎的自然史，给慢性乙型肝炎的防治工作造成困难。临床耐药管理的现实具体问题是，当前针对耐药所采取的主要“救援”治疗方法，有可能降低后续治疗药物的疗效，增加其耐药发生的风险，甚至发生所谓“多药耐药性肝炎”，使进一步治疗药物选择受限。因此，有效地管理核苷（酸）类似物抗HBV治疗临床耐药，需要规范与耐药相关的概念，了解不同结构类型药物的耐药途径，正确、客观分析各个药物采用不同的监测人群、检测手段和分析方法得到的耐药数据，通过管理时间前移（提前）的观念（即从现在的“救援”治疗，前移至早期预测乃至起点预防），加强监测，有效干预，才能在临床实践中避免或延迟耐药的发生。二、耐药及耐药变异的相关概念由于对HBV的研究及抗病毒治疗的飞速发展，目前国际上的耐药术语和相关概念还没有形成统一的标准。这一现象与不同临床试验设计所产生结果是否具有可比性，以及HBV耐药的复杂性都有一定关系。因此，规范耐药相关名词和标准对慢性乙型肝炎的疗效评价和耐药管理有着重要意义。耐药是由于HBV对药物发生适应性突变，导致药物抑制病毒作用的敏感度下降，临床的相应表现为被抑制的病毒重新复制（HBV重新升高），再次出现肝损害表现（ALT重新升高）。相关的术语包括基因型耐药、表型耐药、病毒学突破、生物化学突破、交叉耐药、多药耐药。基因型耐药（genotypic resistance）是指出现了导致药物靶位氨基酸变异的单核苷酸变异，这些变异在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关；表型耐药（phenotypic resistance）是指将检测到的核苷酸变异及其编码的氨基酸替代变异病毒株，通过体外复制系统证实降低了其对抗病毒药物的敏感性；病毒学突破（virologic breakthrough）指在治疗过程中，虽然患者对药物治疗有良好的依从性，相隔1个月的连续2次检查，血清HBV DNA载量比获得应答后的最低值的上升值均1 log10 拷贝/ml，常提示耐药的产生；生物化学突破（biochemical breakthrough）是指治疗达到ALT复常后，在继续治疗的过程中，ALT水平升高并超过正常值上限；交叉耐药（cross resistance）指在抗HBV的治疗中，当使用一种药物造成这些靶位氨基酸变异后，这一耐药病毒株对其他具有相同作用靶位的药物也具有耐药性；多药耐药（multidrug resistance）指序贯或同时使用不同作用靶位的药物进行治疗，HBV可在不同药物的靶位发生耐药变异，产生对多种药物耐药的变异病毒株。临床发现，耐药依赖于患者对抗病毒药物治疗的应答，目前抗病毒药物治疗的病毒学应答主要分为：完全应答（complete response），指HBV DNA60 IU/ml（300拷贝/ml）；非理想应答（suboptimal response），指治疗12周时HBV DNA水平自基线下降1 log10拷贝/ml，但23 log10拷贝/ml；部分应答（partial response），指治疗24周时HBV DNA水平在602000IU/ml（300104拷贝/ml）；不充分应答（inadequate response），指治疗24周时HBV DNA水平2000 IU/ml（104拷贝/ml）。抗病毒耐药的临床相关概念包括：原发性治疗失败（primary treatment failure）或原发性无应答（primary nonresponse）。原发性治疗失败多与原发性耐药及宿主免疫等因素有关，目前国际标准不一，如美国肝病学会的标准为治疗24周时，HBV DNA下降2 log10拷贝/ml，NIH工作组、耐药工作小组（drug resistant group）和International Panel的标准为治疗24周时，HBV DNA下降5 log10拷贝/ml的人群，替比伏定1年基因型耐药的发生率更低，为3%和2%。因此，在临床耐药检测中，目前推荐，在所有治疗过程中，HBV DNA处于PCR可检测水平或出现病毒学突破的患者中进行全面基因耐药检测，这可能更符合临床研究的实际情况。耐药位点检测方法主要有直接测序法、限制性片段长度多态性技术（RFLP）、Inno-LiPA。当在一个新药的研发阶段，未知其相关的耐药位点变异时，主要采用直接测序法，该方法能够发现乙型肝炎病毒基因组新的变异，进一步通过表性分析判断该变异是否与对药物敏感性降低有关，但是该检测方法的敏感性较低，只有变异的乙型肝炎病毒株占整个准种池的20%时才能被检出。而RFLP和Inno-LiPA技术的敏感性较高，能检出占准种池5%的变异株，但这两项技术仅能检测已知耐药位点。现有核苷初治患者中耐药发生率仅拉米夫定有RFLP检测的数据2，其他3个核苷（酸）类似物耐药发生率都是在其药物研发阶段的临床研究中得到的，所用方法为直接测序法。计算耐药发生率目前多采用通过累计发生率（cumulative probability）的方法，因为在长期核苷类药物治疗过程中一定伴随着患者的丢失，所以应用此种统计学方法同样较为符合临床客观实际。拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦均有这种方法计算的耐药数据。替比夫定采用的是ITT分析，2年的耐药数据更为全面准确。因此，我们在分析一个核苷类药物的耐药发生率时，需要全面考虑以上几个方面的因素，简单争议某一个药临床耐药发生率是百分之几或几十是毫无临床价值和意义的。拉米夫定：最早用于慢性乙型肝炎抗病毒治疗的核苷类药物，属于左旋类核苷类似物，其耐药发生率最高，大大地限制了药物的应用。其治疗14年的基因型耐药的累计发生率为23%71%。替比夫定：同属于左旋类核苷结构的药物，其抑制HBV复制的能力强大。在全球临床试验资料中，替比夫定治疗2年的ITT分析发现，HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎患者中因基因型耐药而导致病毒学突破的比例分别为21.6%和8.6%，其突变模式主要是rtM204I，也有少许rtM204混合型，并未见rtM204I/L180M的联合突变。但与之对照的拉米夫定组第一年（48周）突变率为10.5%，第二年（104周）为30%，突变模式包括rtM204I/V、rtM204混合型及rtM204I/L180M 3种。阿德福韦酯：由于其潜在的肾毒性，在获准上市时选择了10 mg非最优剂量。阿德福韦酯长期的耐药发生率目前仅有HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者的数据，治疗15年的累计基因型耐药发生率为029%，其主要变异模式为rtA181V和rtN236T，其中rtA181位点值得进一步研究。恩替卡韦：在目前上市的核苷类药物中抗病毒作用最强，同时需要多个位点置换才能够产生临床耐药（高耐药基因屏障），在核苷类药物初治患者中的长期治疗累计基因型耐药发生率最低。恩替卡韦治疗核苷类药物初治患者15年累计基因型耐药发生率仅为0.2%1.2%。同时恩替卡韦耐药需要有拉米夫定耐药位点置换的背景，当患者在恩替卡韦治疗前已有拉米夫定耐药位点置换，只需再出现一个恩替卡韦耐药相关位点置换就能产生耐药（低耐药基因屏障）。因此，恩替卡韦在拉米夫定失效患者中的耐药发生率明显增加，15年的累计基因型耐药发生率为6%51%。替诺福韦：在HIV/HBV共感染患者的长期研究中，大多数队列研究没有发现耐药发生。针对HBV感染的欧洲48周临床试验结果也无耐药出现。替诺福韦用于拉米夫定治疗失败者，至今也无耐药发生的报道。所以，替诺福韦也应属于低耐药发生的核酸类似物，结合其强大的抑制病毒效力，并伴有较好的血清学转换水平，显示其巨大的临床应用前景。六、耐药临床管理影响病毒耐药的因素主要涉及到三个方面：病毒、宿主和药物。其中我们能够从临床上加以影响和控制的是治疗药物和方案选择，以及增强患者的依从性。在长期治疗的临床实际操作中，如主要从耐药发生及管理角度考虑，药物选择主要应关注抗病毒强度和耐药基因屏障两大因素。目前耐药管理策略主要为预防耐药和预测耐药（roadmap概念），而耐药临床管理的新观念就是“管理时间前移”，即从发生临床耐药（生物化学突破）时间点前移至发生病毒学突破时间点再前移至病毒学应答不满意（早期病毒学应答预测），将来可能发生耐药时间点最终则应前移至治疗起点，即预防耐药管理概念。预防耐药主要指在初始选择抗病毒治疗时就考虑如何降低耐药的风险，延缓耐药发生，当前主要有两种治疗策略：(1) 初始治疗选择兼具强效和高耐药基因屏障低耐药发生率的抗病毒药物单药治疗；(2) 初始治疗选择没有交叉耐药的两种以上抗病毒药物联合治疗。预测耐药指当已经开始一个低基因屏障高耐药发生率的抗病毒药物治疗时，如何根据患者治疗中监测早期应答情况及时调整、改变现有的治疗策略，以降低该药物治疗的耐药风险，即治疗路线图概念。（一）预防耐药预防耐药除了从初始治疗的选择着手外，还需注意：(1) 理智应用抗病毒治疗，即选择合适的患者在合适的时机开始合适抗病毒治疗（包括选择合适的药物和方案）；(2) 避免单药序贯治疗，防止因为单药序贯治疗导致后续治疗药物疗效下降、耐药风险上升，使长期乙型肝炎抗病毒治疗的选择受限；同时有产生多药耐药的风险；(3) 避免选择存在交叉耐药的药物，限制未来治疗方案的选择。从长期治疗必须考虑预防或延迟耐药发生这一角度考虑，选择强效、低耐药的药物，即所谓高耐药基因屏障和（或）低耐药发生率药物（如恩替卡韦或替诺福韦）单药治疗为重要预防耐药方案。临床现有数据证明，90%的患者通过这一方案可达到长期持续抑制HBV复制的治疗基本目标。另一预防或延迟耐药发生的方法为联合治疗的策略，即抗病毒治疗的起始即联合两种以上药物相加同时使用。目前临床研究数据显示，联合治疗方案可以降低耐药的发生。但通过联合治疗以期达到增加抗病毒疗效，同时又降低（延迟）耐药发生的双重效果，迄今仍无明确答案和标准方法。如：拉米夫定和聚乙二醇化干扰素联合治疗1年，其耐药发生率为1%4%；和阿德福韦酯联合治疗2年耐药发生率为15%16；和替比夫定联合治疗1年耐药发生率为10%17。由此看来，从预防耐药发生策略来讲，联合一个低耐药基因屏障高耐药发生率的抗病毒药物，能够降低该药物的耐药风险，但没有完全防止耐药的发生；而如果联合高耐药基因屏障的药物，目前没有相关的临床研究数据。值得商榷的是，起始联合一个高耐药基因屏障药物有无可能完全防止耐药的发生，将发生率由1%降到0？其次，如果证明这样的联合治疗更佳，做这样的临床研究需要每组1000例患者，是否值得？包括此类药物与干扰素的联合，怎样来评估增加疗效又降低耐药发生，试验设计非常困难。（二）预测耐药近来，根据替比夫定GLOBE研究的分析显示，治疗24周取得完全病毒学应答的患者，其2年治疗的耐药发生率低。如加上选择合适的患者，耐药发生率可降至2%4%，由此，Keeffe等提出了治疗路线图（roadmap）概念，根据评估抗病毒治疗中的早期病毒学应答情况来指导下一步的临床治疗决策，通过调整并优化治疗方案，提高疗效，减少耐药发生。但应提出，目前的治疗路线图概念和方案还远非一完善和理想的优化方案。早期治疗应答和远期疗效的关系，不仅存在于目前乙型肝炎抗病毒治疗，早在丙型肝炎治疗中已经观察到。但是丙型肝炎治疗中早期应答的患者治疗的远期（仅1年预测疗程）结果是能够将HCV清除而治愈，但目前没有一种抗病毒治疗能够将HBV清除，且治疗方法为无疗程的长期治疗。所以目前治疗路线图概念只提供并预测12年治疗的耐药发生情况。通过调整和优化的方法，其长