附录XIV C 细菌内毒素BP2008、2010.doc

C. 细菌内毒素试验（LAL试验）（BP）细菌内毒素检查法系利用鲎试剂（美国鲎或中国鲎）来检测或量化有革兰阴性菌产生的细菌内毒素的方法。细菌内毒素检查包括3种方法：以凝胶形成为基础的凝胶法，基于内源基质解离形成的浊度法，以及基于反应混合物形成后释放的呈色团的显色基质法。本章陈述了下列6种方法：方法A. 凝胶限度试验方法B. 凝胶半定量试验方法C. 浊度动力学方法方法D. 显色动力学方法方法E. 显色终点法方法F. 浊度终点法供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除个论另有规定外，以方法A为准。本实验操作过程应防止内毒素污染。器皿试验所用的玻璃器皿和耐热器皿需用已验证的方法除去热原，常用干热灭菌箱（250,30min以上）去除。若使用塑料器械，如微孔板或自动加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素且对对试验无干扰的器械。注：在本章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板。标准内毒素储备液的制备标准内毒素储备液由经国际标准标定的内毒素标准品制备，如BRP标准内毒素。单位：IU，IU 为世界卫生组织规定单位。1IU=1EU根据包装说明和标签规定制备及储存标准内毒素储备液。标准内毒素溶液制备混匀标准内毒素储备液，再用细菌内毒素用水与储备液制备系列稀释液。尽快使用以防因吸附而失去活性。供试溶液的制备供试溶液的制备通过用细菌内毒素用水溶解、稀释药物或用具提取。某些物质或制剂可能在其他水溶液中被更适当地溶解、稀释或提取。如有必要，调节待测溶液（或稀释液）的pH值，使鲎试剂和样品的混合物pH在由鲎试剂生产者定的pH范围内。通常使用于pH范围在6.0-8.0的产品。pH的调节可以用鲎试剂生产者推荐的酸、碱或适当的缓冲液。酸和碱可以在已去除内毒素的容器中用浓缩液或固体和鲎试剂水制备。缓冲剂必须进行验证无内毒素和干扰因子。确定最大有效稀释倍数（MVD） 最大有效稀释倍数是指供试溶液在可进行内毒素限值检测范围内被允许达到稀释的最大倍数。用以下公式来确定MVD：内毒素限值供试液浓度MVD = 内毒素限值 非肠道药物活性物质的内毒素限值以剂量定义，等于K为人每公斤体重每小时接受的内毒素的临界值；M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。在个论中，非肠道给药活性物质的内毒素限值的制定单位为IU/ml，EU/mg，EU/U（活性单位）等。供试液浓度：若内毒素限值用重量（IU/mg）表示，则供试液浓度单位为mg/ml；若内毒素限值用活性单位（IU/U）表示，则供试液浓度单位为U/ml；若内毒素限值用体积（IU/ml）表示，则供试液浓度单位为ml/ml。为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（IU/ml），或是在浊度法或显色基质法中所使用的标准曲线上内毒素的最低浓度。凝胶法（方法A和B）凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或量化内毒素的方法。在标准条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的浓度即为鲎试剂的标示灵敏度。为确保实验的精确和有效性，将在下面的准备实验中描述确认鲎试剂的标示灵敏度和干扰因子的实验。1.凝胶法准备实验鲎试剂标示灵敏度的确认实验 试验前先确认4个以IU/ml为单位标示灵敏度鲎试剂的平行管。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度确认试验。鲎试剂标示灵敏度的确认至少要用一瓶鲎试剂。用细菌内毒素检查用水（BET）稀释标准内毒素储备液，制备至少4个浓度的USP RSE稀释液，浓度分别为2、0.5和0.25。取装有等容量（如0.1ml）鲎试剂溶液的试管，加入等体积不同浓度的内毒素标准溶液混合。如果使用单个测试量冻干鲎试剂的小瓶或安瓿，可直接加入上述溶液。在371下静置602分钟，避免震动。从恒温器中依次取出试管，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且不从管壁滑脱者为阳性；未形成完整凝胶者为阴性。最低浓度标准溶液显示阴性该试验才有效。反应终点是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的实验。计算反应终点的对数平均值，再用以下公式求逆对数得平均值。终点浓度的几何平均值=antilog（/f）为系列反应终点浓度的总和，f为重复试验试管数。反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值（IU/ml）。当这个值在0.52之间，标示灵敏度确认，并可用于内毒素检查。凝胶法干扰因子试验表2.6.14.-1溶液内毒素浓度/加入内毒素的溶液稀释液稀释倍数内毒素浓度平行试验次数ABCD未加入/供试品溶液2/供试品溶液2/BET用水未附加/BET用水供试品溶液BET用水12481248210.50.25210.50.254444422222溶液A：未检出内毒素试验的供试品溶液B：供试品的干扰试验溶液C：鲎试剂灵敏度的对照溶液D：鲎试剂用水的阴性对照（BET用水）（II）干扰因子试验按表2.6.14.-1 用在可测范围内不含任何内毒素且稀释倍数小于最大有效稀释倍数的供试液制备溶液A、B、C和D。按1. 准备试验（i）鲎试剂灵敏度确认试验项下操作。用1. 准备试验（i）鲎试剂灵敏度确认试验的表达式计算溶液B和溶液C的反应终点浓度几何平均值。当发生任何有可能影响试验结果的变化时，须进行干扰试验。若溶液A和溶液D的所有平行管都为阴性且溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验有效。当溶液B测定的鲎试剂灵敏度在0.52时，可认为供试品在该实验条件下无干扰作用。否则须进行干扰试验。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验，这将有助于消除干扰。可用适宜的方法排除，如过滤，中和，渗析或热处理。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素在经过处理的供试品溶液进行干扰。2.限度试验（方法A）（I）步骤按表2.6.14.-2 制备溶液A、B、C和D，按1. 准备试验（i）鲎试剂灵敏度确认试验项下操作。表2.6.14. -2 凝胶限度试验溶液的制备溶液*内毒素浓度/加入内毒素浓度平行管数A无加入/稀释的供试品溶液2B2/稀释的供试品溶液2C2/BET用水2D无加入/BET用水2使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和阳性对照溶液B，按1. 准备试验（ii）干扰试验项下操作。阳性对照溶液B和C含标准内毒素制剂为相应标示鲎试剂灵敏度的两倍。阴性对照溶液D为鲎试剂水。（II）说明若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，阳性对照溶液B和C的平行管均为阳性，试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。当溶液A的两个平行管中的一管为阳性：若被检查溶液已稀释至MVD，则判定供试品不符合规定；若被检查溶液的稀释倍数小于MVD，则对供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复试验。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。3.半定量试验（方法B）（I）操作本法通过滴定终点来量化供试品中内毒素的含量。按表2.6.14.-3制备溶液A，B，C，D，按1. 准备试验（i）鲎试剂灵敏度确认试验项下操作。（II）计算及解释若实验结果满足以下3个条件，则判定试验有效：（a） 阴性对照试验D的平行管均为阴性；（b） 阳性对照试验B的平行管均为阳性；（c） 系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.52之间。测定溶液A的内毒素浓度，每一系列平行管的终点稀释倍数乘以为每个系列的反应终点浓度。所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度（按1. 准备试验（i）鲎试剂灵敏度确认试验项下的表达式计算）如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。若试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记内毒素浓度小于（或者，检验的是稀释过的供试品，则记为小于乘以供试品进行半定量试验的最低稀释倍数）。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒素浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以（例如表2.6.14.-3中，原始稀释浓度8）。若内毒素浓度小于个论中规定的限值，判定供试品符合规定。表2.6.14.-3 溶液内毒素浓度/加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数内毒素的原始浓度平行管数A未加入/供试品溶液BET用水12482222B2/供试品溶液122C2/BET用水BET用水1248210.50.252222D未附加/BET用水2溶液A：供试品为不超过最大有限稀释倍数的稀释液且通过干扰试验。从通过干扰试验的稀释倍数开始用BET用水做2管稀释，分别为,，最后稀释倍数不超过MVD。其它适当的稀释度也可。溶液B：含2细菌内毒素的溶液（供试品阳性对照）溶液C：两个系列共支管稀释，含标准内毒素浓度为2，,，溶液D：鲎试剂用水（阴性对照）。光度技术（法C,D,F,F）1. 浊度法（法C和F）该法是一种测量浊度增加量的光度测定试验。根据检测原理，可分为反应终点浊度法和动态浊度法。反应终点浊度法（法F）是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度和透光度）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法（法C）是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。该试验应在鲎试剂厂商建议的孵育温度下进行（通常为371）2. 呈色法（法D和E）该法用于检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生酶使底物释放出的发色团。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法（法E）是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法（法D）是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。该试验应在鲎试剂厂商建议的孵育温度下进行（通常为371）。3. 准备试验为保证浊度和显色试验的精确度和有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验和供试品的干扰试验。当发生任何可能影响试验结果的变化时，需做方法验证试验。（I） 标准曲线的可靠性试验用标准内毒素溶液配制至少3个浓度的稀释液以绘制标准曲线。根据鲎试剂厂商的建议对每种标准内毒素溶液进行至少3组平行试验（体积比，培养时间，温度，pH等）。如果想得到大于2倍动力学方法的对数值，必须包括附加标准以囊括在标准曲线范围内每个对数增加值。鲎试剂厂商表明标准曲线的相关系数的绝对值（r）必须大于或等于0.980。，实验方有效。（II） 干扰因子试验选择标准曲线中点或接近中点的内毒素浓度。按表2.6.14.-4制备溶液A，B，C，D。根据鲎试剂厂商要求，每个浓度至少做2支平行管（供试液和鲎试液的体积，体积比，培养时间等）。表2.6.14.-4编号 内毒素浓度被加入内毒素的溶液平行管数A无供试液不少于2支B标准曲线的中点浓度供试液不少于2支C至少3个浓度（最低浓度定为）BET用水各浓度不少于2支D无BET用水不少于2支通过将溶液中包含的附加内毒素减去溶液中内毒素的平均浓度（若含内毒素）计算加入内毒素的平均回收率。在试验条件下，在试验检出浓度减去空白溶液内毒素浓度后，加入内毒素浓度实验值占在已知浓度的50200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。当回收率不在指定的范围内，须按1. 准备试验（ii）干扰试验项下操作排除干扰。通过重复干扰试验验证处理方法的有效性。4.检查（I） 步骤与3.准备试验中（II）干扰因子试验方法一致。（II） 计算根据由系列阳性对照溶液C生成的标准曲线计算溶液A每支平行管的内毒素浓度。试验必须符合以下3个条件方为有效：（1） 阴性对照溶液D获得的结果不超过所用鲎试剂描述的空白值限度；（2） 阳性对照溶液C获得的结果符合3.准备试验，（i）标准曲线的可靠性试验中的要求；（3） 用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50200%范围内。（III） 说明如果经过稀释或浓缩后的系列A溶液的平均内毒素浓度小于产品的内毒素限值，待检制剂符合试验。4. 试剂（I） 鲎试液根据生产商建议，轻微搅拌下将鲎试剂溶于水或缓冲液中。根据要求冷藏或冷冻鲎试液。（II） 鲎试剂鲎试剂是鲎（美洲鲎或中国鲎）的溶菌产物中获得的一种冻干产品，该产品的生产仅遵从主管部门