TaKaRa定量PCR介绍.ppt

March3 2020 实时荧光定量PCR介绍 宝生物工程 大连 有限公司 主要内容 实时荧光定量PCR介绍 2 March3 2020 RealTimePCR基础知识 实时荧光定量PCR介绍 3 March3 2020 RealTimePCR的用途 实时荧光定量PCR介绍 4 March3 2020 RealTimePCR的原理 使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法 RealTimePCR 实时荧光定量PCR介绍 5 March3 2020 RealTimePCR的原理 同一个样品重复96次PCR的扩增曲线 实时荧光定量PCR介绍 6 March3 2020 RealTimePCR扩增过程中 每个反应管内的荧光信号值达到设定的阈值时所经历的循环数 C 代表Cycle t 代表threshold Ct值概念 阈值 在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限 RealTimePCR中的概念 实时荧光定量PCR介绍 7 March3 2020 在PCR反应体系中加入荧光物质 并实时监测荧光信号积累的整个PCR进程 最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析 RealTimePCR的原理 实时荧光定量PCR介绍 8 March3 2020 RealTimePCR检测系统 简介 实时荧光定量PCR介绍 March3 2020 LightCycler 480 Rotor gene6000 MiniOpticon Mx3005PTM LINE GENEFQD 66A ABIPRISM7500 iQ5Real TimePCRDetectionSystem TaKaRaTP800 实时荧光定量PCR介绍 March3 2020 各公司RealTimePCR检测系统比较 实时荧光定量PCR介绍 March3 2020 RealTimePCR基础知识 实时荧光定量PCR介绍 12 March3 2020 TaqManProbe CyclingProbe MolecularBeacon etc SYBRGreenI 荧光染料嵌合法 荧光探针法 RealTimePCR的检测方法 实时荧光定量PCR介绍 13 March3 2020 荧光染料嵌合法 SYBRGreenI SYBRGreenI 是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料 SYBRGreenI 实时荧光定量PCR介绍 14 March3 2020 F SYBRGreenI法作用机理示意图 实时荧光定量PCR介绍 15 March3 2020 TaqMan法作用机理 TaqMan探针为一寡核苷酸 5 端标记一个报告基团 Reporter 3 端标记一个淬灭基团 Quencher Q 实时荧光定量PCR介绍 16 March3 2020 TaqManProbe法原理示意图 实时荧光定量PCR介绍 17 March3 2020 CycleavePCR法原理 Cyclingprobe为一寡核苷酸 一端标记一个荧光报告基团 Reporter 一端标记一个荧光淬灭基团 Quencher 寡核苷酸为DNA RNA杂合体 RNaseH 实时荧光定量PCR介绍 18 March3 2020 CycleavePCR法原理示意图 实时荧光定量PCR介绍 19 March3 2020 SYBRGreenI法与Probe法比较 常用于mRNA表达量分析等 SYBRGreenI法 简便易行 价格便宜 要求反应的特异性 不能进行多重PCR 常用于SNP解析 病毒 病源菌检测 实时荧光定量PCR介绍 20 March3 2020 主要内容 实时荧光定量PCR介绍 21 March3 2020 OneStep和TwoStepRT PCR的选择 实时荧光定量PCR介绍 22 March3 2020 Two StepRT PCR One StepRT PCR One StepRT PCR OneStep和TwoStepRT PCR的选择 实时荧光定量PCR介绍 23 March3 2020 RTPrimer的选择 RandomPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimer Random6merPrimer GeneSpecificPrimer OligodTPrimer PCRR Primer PCRF Primer 实时荧光定量PCR介绍 24 March3 2020 RTPrimer的选择 实时荧光定量PCR介绍 25 March3 2020 TotalRNA中GenomicDNA混入的对策 PCRPrimer exon intron exon GenomicDNA cDNA exon exon PCRPrimer RealTimePCR RealTimeRT PCR SmallPCRProduct SmallPCRProduct 此种情况必须采用DNaseI处理 去除基因组DNA 融解曲线分析 实时荧光定量PCR介绍 26 March3 2020 PCRPrimer exon intron exon GenomicDNA cDNA exon exon PCRPrimer RealTimePCR RealTimeRT PCR LongPCRProductorNoProduct SmallPCRProduct 融解曲线分析 可以区分cDNA或者基因组DNA来源的扩增产物 TotalRNA中GenomicDNA混入的对策 实时荧光定量PCR介绍 27 March3 2020 PCRPrimer exon intron exon GenomicDNA cDNA exon exon PCRPrimer RealTimePCR RealTimeRT PCR NoProduct SmallPCRProduct 融解曲线分析 TotalRNA中GenomicDNA混入的对策 实时荧光定量PCR介绍 28 March3 2020 RealTimePCR引物设计 目的是获得目的基因 对非特异性反应和引物二聚体要求不严格 目的是让目的基因按照理论值进行扩增 对非特异性反应和引物二聚体要求严格 RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同 对引物设计要求严格 普通PCR引物 RealTimePCR引物 实时荧光定量PCR介绍 29 March3 2020 RealTimePCR引物设计原则 实时荧光定量PCR介绍 30 March3 2020 RefSeq序列 好的引物需要寻找好的参照序列 RealTimePCR引物设计 通过NCBI获得参考序列和相关情报 RefSeq数据库提供无重复 准确性 完整性的基因参考序列 序列可信度高 信息量大 实时荧光定量PCR介绍 31 March3 2020 LOCUSNM 0087771959bpmRNAlinearROD15 APR 2005DEFINITIONMusmusculusphenylalaninehydroxylase Pah mRNA ACCESSIONNM 008777VERSIONNM 008777 1GI 6679202SOURCEMusmusculus housemouse ORGANISMMusmusculusFEATURESLocation Qualifiersgene1 1959 gene Pah db xref GeneID 18478 db xref MGI 97473 CDS48 1409 gene Pah note go function ironionbinding goid0005506 protein id NP 032803 1 db xref GI 6679203 db xref GeneID 18478 db xref MGI 97473 ORIGIN1aattcaaccctgtgctaagctagacacctcacttactgagagccagcatggcagctgttg61tcctggagaacggagtcctgagcagaaaactctcagactttgggcaggaaacaagttaca121tcgaagacaactccaatcaaaatggtgctgtatctctgatattctcactcaaagaggaag181ttggtgccctggccaaggtcctgcgcttatttgaggagaatgagatcaacctgacacaca241ttgaatccagaccttcccgtttaaacaaagatgagtatgagtttttcacctatctggata301agcgtagcaagcccgtcctgggcagcatcatcaagagcctgaggaacgacattggtgcca361ctgtccatgagctttcccgagacaaggaaaagaacacagtgccctggttcccaaggacca421ttcaggagctggacagattcgccaatcagattctcagctatggagccgaactggatgcag481accacccaggctttaaagatcctgtgtaccgggcgagacgaaagcagtttgctgacattg541cctacaactaccgccatgggcagcccattcctcgggtggaatacacagaggaggagagga601agacctggggaacggtgttcaggactctgaaggccttgtataaaacacatgcctgctacg661agcacaaccacatcttccctcttctggaaaagtactgcggtttccgtgaagacaacatcc721cgcagctggaagatgtttctcagtttctgcagacttgtactggtttccgcctccgtcctg781ttgctggcttactgtcgtctcgagatttcttgggtggcctggccttccgagtcttccact841gcacacagtacattaggcatggatctaagcccatgtacacacctgaacctgatatctgtc901atgaactcttgggacatgtgcccttgttttcagatagaagctttgcccagttttctcagg961aaattgggcttgcatcgctgggggcacctgatgagtacattgagaaactggccacaattt1021actggtttactgtggagtttgggctttgcaaggaaggagattctataaaggcatatggtg1081ctgggctcttgtcatcctttggagaattacagtactgtttatcagacaagccaaagctcc1141tgcccctggagctagagaagacagcctgccaggagtatactgtcacagagttccgacctc1201tgtactatgtggccgagagtttcaatgatgccaaggagaaagtgaggacttttgctgcca1261caatcccccggcccttctccgttcgctatgacccctacactcaaagggttgaggtcctgg1321ataatactcagcagttgaagaatttagctgactccattaatagtgaggttggaatccttt1381gccatgccctgcagaaaataaagtcatgaacagaaagtgacgtcatagacagaacttagg1441aggtcaaccaaaaaaatctgctgatagaagtatagtaactgcttcttttccctgaagaag1501aaaagttttatttgcaatgtcagcttttaatatattttcctaacatagtggaggatcacc1561aaataaatcaatttctctgaatgaaagtatattaaaacccatcagtggtagatccttcag1621agtcacatttgatttagatatctcagaccttcaatttggtttaaaatgtaatttctcagt GenBankfile NM 008777 Musmusculusphenylalaninehydroxylase Pah mRNA RealTimePCR引物设计 实时荧光定量PCR介绍 32 March3 2020 1aattcaaccctgtgctaagctagacacctcacttactgagagccagcatggcagctgttg61tcctggagaacggagtcctgagcagaaaactctcagactttgggcaggaaacaagttaca121tcgaagacaactccaatcaaaatggtgctgtatctctgatattctcactcaaagaggaag181ttggtgccctggccaaggtcctgcgcttatttgaggagaatgagatcaacctgacacaca241ttgaatccagaccttcccgtttaaacaaagatgagtatgagtttttcacctatctggata301agcgtagcaagcccgtcctgggcagcatcatcaagagcctgaggaacgacattggtgcca361ctgtccatgagctttcccgagacaaggaaaagaacacagtgccctggttcccaaggacca421ttcaggagctggacagattcgccaatcagattctcagctatggagccgaactggatgcag481accacccaggctttaaagatcctgtgtaccgggcgagacgaaagcagtttgctgacattg541cctacaactaccgccatgggcagcccattcctcgggtggaatacacagaggaggagagga601agacctggggaacggtgttcaggactctgaaggccttgtataaaacacatgcctgctacg661agcacaaccacatcttccctcttctggaaaagtactgcggtttccgtgaagacaacatcc721cgcagctggaagatgtttctcagtttctgcagacttgtactggtttccgcctccgtcctg781ttgctggcttactgtcgtctcgagatttcttgggtggcctggccttccgagtcttccact841gcacacagtacattaggcatggatctaagcccatgtacacacctgaacctgatatctgtc901atgaactcttgggacatgtgcccttgttttcagatagaagctttgcccagttttctcagg961aaattgggcttgcatcgctgggggcacctgatgagtacattgagaaactggccacaattt1021actggtttactgtggagtttgggctttgcaaggaaggagattctataaaggcatatggtg1081ctgggctcttgtcatcctttggagaattacagtactgtttatcagacaagccaaagctcc1141tgcccctggagctagagaagacagcctgccaggagtatactgtcacagagttccgacctc1201tgtactatgtggccgagagtttcaatgatgccaaggagaaagtgaggacttttgctgcca1261caatcccccggcccttctccgttcgctatgacccctacactcaaagggttgaggtcctgg1321ataatactcagcagttgaagaatttagctgactccattaatagtgaggttggaatccttt1381gccatgccctgcagaaaataaagtcatgaacagaaagtgacgtcatagacagaacttagg1441aggtcaaccaaaaaaatctgctgatagaagtatagtaactgcttcttttccctgaagaag1501aaaagttttatttgcaatgtcagcttttaatatattttcctaacatagtggaggatcacc1561aaataaatcaatttctctgaatgaaagtatattaaaacccatcagtggtagatccttcag1621agtcacatttgatttagatatctcagaccttcaatttggtttaaaatgtaatttctcagt1681tctcatcaacattcatcaaatttgggactcatatcatttgggctctgtctgttcattttt CCTGGCCAAGGTCCTGCG TTGGAACCAGGGCACTGTGT AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG TCTTCTCTAGCTCCAGGGGC AAAGTCATGAACAGAAAGTGA GTGATCCTCCACTATGTTAG Forward Reverse RealTimePCR引物设计 实时荧光定量PCR介绍 33 March3 2020 CCTGGCCAAGGTCCTGCG TTGGAACCAGGGCACTGTGT AAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTAC TTCAGAGTCCTGAACACCGTTCC ACTCTTGGGACATGTGCCCTTG TCTTCTCTAGCTCCAGGGGC AAAGTCATGAACAGAAAGTGA GTGATCCTCCACTATGTTAG Forward Reverse 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 SNP 3 末端的T 3bp互补 RealTimePCR引物设计 实时荧光定量PCR介绍 34 March3 2020 RealTimePCR引物设计 31 实时荧光定量PCR介绍 35 March3 2020 RealTimePCR用TaqMan探针设计原则 RealTimePCR探针设计原则 实时荧光定量PCR介绍 36 March3 2020 探针荧光标记物的选择 实时荧光定量PCR介绍 37 March3 2020 线性关系 扩增效率确认 检测灵敏度确认 PCR扩增效率 E 0 8 1 2 35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法 30Cycles内无非特异性产物扩增 相关系数 r2 大于0 98 反应性能确认 实时荧光定量PCR介绍 38 March3 2020 标准Protocol95 5sec 60 30sec B 有非特异性扩增时提高退火 延伸温度缩短退火 延伸时间降低引物浓度 PCR条件优化顺序 实时荧光定量PCR介绍 39 March3 2020 主要内容 实时荧光定量PCR介绍 40 March3 2020 标准曲线制作 扩增曲线 标准曲线 标准品梯度的选择 5 6个梯度标准品稀释倍数的选择 标准品稀释倍数通常为5 10 105104103102101100 105104103102101100 实时荧光定量PCR介绍 41 March3 2020 标准品的种类 实时荧光定量PCR介绍 42 March3 2020 质粒标准品的构建 紫色部分为RealTime引物区 红色部分为标准品构建用引物区 质粒标准品引物设计 AGTACCTAGATCCTAG AGTACCTAGATCCTAG 实时荧光定量PCR介绍 43 March3 2020 质粒标准品构建流程 基因组DNA PCR 目的基因克隆 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 质粒提取 OD值定量 将质粒梯度稀释至105 101copies ul 作为标准品 实时荧光定量PCR介绍 44 March3 2020 RNA标准品构建 紫色部分为RealTime引物区 红色部分为标准品构建用引物区 蓝色部分T7启动子和Poly T 实时荧光定量PCR介绍 45 March3 2020 体外转录RNA标准品构建流程 RNA纯化后 测OD定量 将RNA梯度稀释至105 101copies ul 作为标准品 T7RNApolymerase 体外转录RNA TotalRNA PCR cDNA RT T7Promoter TTTT T PCR产物 目的基因 目的基因 目的基因 AAAA A AAAA A 实时荧光定量PCR介绍 46 March3 2020 理想的标准品扩增曲线 基线平整NegativeControl为水平线指数区较明显 陡度大平台区汇于一起线性范围宽 实时荧光定量PCR介绍 47 March3 2020 理想的标准曲线 相关系数 r2 大于0 98 越接近1 结果可信度越高 扩增效率 E 0 8 1 2 越接近1 越理想 扩增效率 相关系数 扩增效率 E 计算方法 标准曲线X轴表示起始模板浓度 log10 Y轴表示Ct值时E 10 1 a 1标准曲线X轴表示Ct值 Y轴表示起始模板浓度 log10 E 10 a 1 实时荧光定量PCR介绍 48 March3 2020 RealTimePCR解析方法 实时荧光定量PCR介绍 49 March3 2020 融解曲线分析 Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度 SYBRGreenI法进行检出时 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性 实时荧光定量PCR介绍 50 March3 2020 特异性产物 非特异产物 引物二聚体 对PCR产物特异性进行分析 融解曲线分析 实时荧光定量PCR介绍 51 March3 2020 RealTimePCR解析方法 实时荧光定量PCR介绍 52 March3 2020 绝对定量解析方法 提取样品 引物设计 标准品制备 RealTimePCR反应 数据分析 流程 实时荧光定量PCR介绍 53 March3 2020 绝对定量解析方法 通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度 通常应用于病毒 细菌 衣原体 支原体的定量检测及转基因食品的检测 105 104 103 101 扩增曲线图 标准曲线图 检测样品 检测样品 102 实时荧光定量PCR介绍 54 March3 2020 相对定量解析方法 以上条件不可能同时得到满足 必须用内对照基因 管家基因 校正 进行相对表达量分析 进行相对表达量分析必要性 实际上目的基因表达量分析 实时荧光定量PCR介绍 55 March3 2020 相对定量解析方法 管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因 如 GAPDH actin等 筛选方法 根据文献提供通过具体实验筛选 实时荧光定量PCR介绍 56 March3 2020 相对定量解析方法 通过标准曲线对对照样品 检测样品的目的基因及管家基因进行定量 然后以管家基因的定量结果为依据对目的基因进行比值校正 求得相对值即为相对表达量 相对值 校正值 目的基因定量结果 管家基因定量结果 检测样品的校正值 对照样品的校正值 通过对照样品 检测样品的目的基因及管家基因的Ct值 然后以管家基因的Ct值为依据对目的基因进行差值校正 最终求得相对表达量 双标准曲线法 Ct法 相对值 2 Ct 目检 管检 Ct 目对 管对 实时荧光定量PCR介绍 57 March3 2020 主要内容 实时荧光定量PCR介绍 58 March3 2020 定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析 实时荧光定量PCR介绍 59 March3 2020 SNP解析原理示意图 实时荧光定量PCR介绍 60 March3 2020 CyclingProbe法 PCR RFLP法 ROX FAM ROX FAM通道均有信号检出 Eco57ICTGAAG N 16GACTTC N 14wildtype 切断Mutanttype 不切断 ROX FAM Mutant wild ROX通道有信号检出 FAM通道检出荧光信号 ROX FAM 杂合型 hetero 野生型 wildhomo 突变型 mutanthomo 定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析 实时荧光定量PCR介绍 61 March3 2020 定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析 提取样品 引物 探针设计 RealTimePCR反应 数据分析 流程 实时荧光定量PCR介绍 62 March3 2020 从人血液中 共计10个样品 提取基因组DNA 样品提取 提取试剂 BloodGenomeDNAExtractionKit D9081 定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析 定量反应 反应试剂 CycleavePCR CoreKit DCY501 实时荧光定量PCR介绍 63 March3 2020 实验结果 Allele1 突变型 Allele2 野生型 定性分析应用例对人的ALDH2基因进行SNP解析 Hetero 杂合型 实时荧光定量PCR介绍 64 March3 2020 绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 检测方法TaqMan probe法检测样品3个从SARS病毒培养液中提取的GenomicRNA目的基因SARS病毒RNA内参SARSInternalControlRNA标准品SARSControlRNA试剂OneStepPrimeScript RT PCRKit PerfectRealTime DRR064 仪器SmartCycler 实时荧光定量PCR介绍 65 March3 2020 pBluescriptIISK Vector T7Promoter SARSControlRNA构建 绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 实时荧光定量PCR介绍 66 March3 2020 纯化的SARSControlRNAOD值测定结果 体外转录的SARSControlRNA电泳照片 M1M2 M1 Hind digestM2 DL2 000Marker DNaseI处理前 DNaseI处理后 绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 实时荧光定量PCR介绍 67 March3 2020 DNA T7Promoter SARSInternalControlRNA的构建 pBluescriptIISK Vector 绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 实时荧光定量PCR介绍 68 March3 2020 体外转录的InternalControlRNA电泳照片 M1 Hind digestM2 DL2 000Marker 纯化的SARSInternalControlRNAOD值测定结果 M1M2 DNaseI处理前 DNaseI处理后 绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量 实时荧光定量PCR介绍 69 March3 2020 探针的选择 绝对定量应用