蛋白质组学研究方法_cropped.doc

基础医学 蛋 白 质 组 学 研究 方 法陈姗综述刘志红审校关键词 蛋白质组学2 2D 电泳 色谱技术 质谱技术芯片技术蛋白质相互作用随着人类功能基因组计划的实施和推进 ,以蛋白质组 ( P ro teom e ) 和蛋白质组学 ( P ro teom ic s) 的 提 出为标志 ,人类从蛋白质水平全面揭示生命本质的 研究进入一个全新的领域 。“工欲善其事 , 必先 利其器 ”,近年来蛋白质组学的迅猛发展与研究方法 的改进和研究手段的提高是密不可分的 。蛋白质组 学的发展是伴随着蛋白质研究技术 ,尤其是双向凝 胶电泳 ( 2 2D 凝胶电泳 )和新型质谱技术以及生物信 息学的发展而发展的 。本文将对主要蛋白质组学技术作一概述 。从技术角度而言 ,主要得益于以下两方面的成功 : 蛋白分离技术 ,包括以凝胶为基础的或不需要凝胶 的 ,以 2 2D 凝胶电泳为代表 ; 质谱技术 (m a ss sp ec2 tro scop y, M S) 4 。此外 ,生物信息学的发展 ,包括生 物分析软件的完善和信息平台及数据库的建立也是不可缺少的 。基因虽是遗传信息的源头 ,而功能性蛋白是基 因功能的执行体 。同一个基因通过不同的翻译后修饰 ( po sttran sla tiona l mod ifica tion s, PTM s) 可以产生不 同的蛋白 。蛋白质是生理功能的执行者 ,是生命现象的直接体现者 ,对蛋白质结构和功能的研究将直蛋白质组学及其研究技术平台接阐明生命在生理或病理条件下的 变 化机 制 4 , 5 。而我们要了解这些蛋白质的信息 ,就必须通过一系列的蛋白质研究方法 。蛋白质组学方法的建立使我 们能够对生命体蛋白质进行更广 、更细 、更大通量的 研究 。一般来说 ,蛋白质组学平台包括以下几大部 分 :前期的样本提取纯化 ,中期的蛋白分离和蛋白分 析 、鉴定 ,以及后期的数据分析 。前期的样本提取纯 化是以既往的生物化学 、细胞生物学和分子生物学技术为基础 , 近年来激光捕获微分离 ( la se r cap tu rem ic rod issec tion, LCM )等新方法的应用为样本更精 确和完备的制备提供了条件 。中期的蛋白分离和蛋 白分析 、鉴定是蛋白质组学技术的核心部分 ,后期的 数据分析是对其必不可少的辅助 。典型的蛋白质组 学分析是在蛋白提取后 ,先凝胶的 (如 2 2D 电泳 )或 非凝胶的 (如液相色谱 )方法分离蛋白 ,然后以不同 的质谱分析方法进行蛋白分析 、鉴定 ,接着以生物信 息学辅助获取和深入分析全面的信息 ,并可以指导1994 年 , 澳 大 利 亚 M acqua rie 大 学 的 M a rcW ilk in s和 Ke ith W illiam s在意大利召开的一次科学 会议上首次提出了“蛋白质组 ”的概念 。蛋白质组( P ro teom e)一词是由英文单词蛋白质 ( P ro te in)的前半部分加上基因组 ( Genom e)的后半部分组合而成 ,其意指 基 因 组 表 达 产 生 的 所 有 相 应 的 蛋 白 质 1 。1995年 W a singe r等 1 第 一 次 在 出 版 物 中 ( E lec tro2p ho re sis)使用了该词 ,并定义为“细胞或组织或机体 内全部蛋白质的存在及其活动方式 ”, 同时提出了“蛋白质 组 学 ( P ro teom ic s) ”一 词 。自 此 以后 , 蛋 白质组学成为生命科学中一个全新的领域 。蛋白质组 学是一门对某一生物或细胞在特定生理或病理状态 下表达的所有蛋白质的特征 、数量和功能进行系统性研究的科学 2 。近年 来蛋 白 质组 学的 发 展非 常 迅速 ,以发表的相关文章为例 , 最早 1995 年只有 3 篇 ,至 2003 年 累 计 有 4 925篇 , 2004 年 已 近 10 000 篇 3 。蛋白质组学发展 ,除了基因组学的发展尤其 是人类和其他物种基因全长测序的基本完成以外 , 4 , 68 更深层的功能蛋白质学研究。蛋白质组学研究技术二维聚丙烯酰胺凝胶电泳1975 年 O fa rre ll作者单位 南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南京 , 210002 )和 Klo se首先在两个实验室分别建立了二维聚丙烯酰胺 凝 胶 电 泳 技 术 ( two2d im en siona l po lyac rylam idege l e lec trop ho re sis, 2 2D 电泳 ) ,亦称双向凝胶电泳技 术 ,其基本原理是利用不同蛋白质具有不同等电点 ( p I)和不同分子量大小的特点将它们分离 。他们将 高分辨 率 的 等 电 聚 集 电 泳 ( isoe lec trofocu sing, IEF )和 SD S聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SD S2PA GE )联合组成 双向电泳 ,第一向为 IEF,采用经典的两性电解质载 体在电流作用下形成 pH 梯度 ,依据 p I的不同进行 分离 ;第二向利用 SD S2PA GE 根据分子量大小进行 分离 9 , 10 。 1982年固相 pH 梯度 ( IPG) 应用于等电聚集电泳 。与传统两性电解质载体在电流作用下形 成 pH 梯度不同 , IPG由丙烯酰胺衍生物与聚丙烯酰 胺共价聚合而成固相 pH 凝胶梯度 。 IPG形成的 pH 梯度稳定 , 聚集准确 , 消除了传统 IEF 阴极漂移 问 题 ,显著提高了双向凝胶电泳结果的重复性 11 , 12 。2 2D 凝胶电泳一般包括样品制备 、IEF 电泳 、平 衡 、SD S电泳 、染色和保存 。样品制备方法根据样本 蛋白的不同而有所不同 ,目的主要在于尽可能完全 获取蛋白质的同时去除非蛋白成分 。样品制备后 , 在预制的 IPG胶条上电泳使具有不同 p I的蛋白质分离 ,然后在第二向利用水 平或 垂直 的 SD S2PA GE 使蛋白质按分子量大小分离 。经过电荷和质量两次 分离后 ,具有不同等电点和分子量信息蛋白质分子 就具有不同的定位 。凝胶染色有考马斯亮兰 、银染 、 同位素标记 、荧光标记等不同方法 ,也可以将蛋白转至 PVD F ( po lyvinylidene d ifluo ride ) 膜 上 后 再 显 色 。 染色的电泳图经扫描和计算机处理后 ,就可以得到 相应样品的“2 2D 电泳图谱 ” 11 , 12 。将不同生理或 病理生理条件下的样本分别进行 2 2D 凝胶电泳 ,再 将它们的 2 2D 电泳图谱进行比较 ,就可以获取在相 应生理或病理生理条件下发生 改变 的蛋 白 质的 信息 ,即所谓的“比较蛋白质组学 ”。 2 2D 电泳后凝胶 上的蛋白质可以切割分离纯化 ,用以进一步的分析鉴定 1317 。2 2D 凝胶电泳可以使我们较快地获取样本整个 蛋白质组大量蛋白质变化 、分布的宏观信息 ,同时也 可以借助后续的方法进行微观分析 。此外 ,它还具 有大通量 的 优 势 。 2 2D 凝 胶 电 泳 也 有 其 自 身 局 限 性 ,主要在于 : 低丰度表达蛋白的鉴定 。人体的低 丰度表达蛋白往往是重要信号转导和调节蛋白及受 体 ,但是在 2 2D 凝胶电泳时 ,高丰度的蛋白常可掩盖 低丰度表达蛋白的检出 ; 膜蛋白等难溶蛋白的检测 。膜蛋白涉及信号转导 、细胞粘附 、代谢和离子转运等重要生命活动 ,但是能以 2 2D 凝胶电泳检测出 的完整膜 蛋 白 只 占 总 量 的 极 少 数 ; 分 子 量 过 大 ( 200 kD )或过小 ( 10 kD ) 蛋白质的分离 ; 极 12 , 13 , 16 , 17 。酸或极碱蛋白的分离随着技术的进步 ,蛋白分离方法在不断改进 ,二维色谱等液相分离技术日益成熟 ,将来也许可对 2 2D 凝胶电泳形成补充和替代 57 , 17 。 色谱技术色谱法又 称 层 析 法 , 其 原 理 是 溶 于 流 动 相(mob ile p ha se ) 中 的 各 组 分 经 过 固 定 相 ( sta tiona ryp ha se)时 ,与固定相发生相互作用 (吸附 、分配 、离子 吸引 、排 阻 、亲 和 等 ) , 由 于 作 用 的 大 小 、强 弱 等 不 同 ,各组分在固定相中滞留的时间不同 ,由此从固定 相中流出的先后也不同 ,最终使不同组成成分得到分离 。色谱法根据分离原理分类 ,有吸附色谱 、分配 色谱 、离子交换色谱 、排阻色谱 、凝胶渗透色谱及亲 和色谱等 。按操作形式可分为纸色谱法 、薄层色谱 法 、柱色谱法等 。根据流动相的物理状态不同可分 为 :气相色谱法 ( ga s ch rom a tograp hy, GC ) 和液相色谱法 ( liqu id ch rom a tograp hy, LC ) 。 GC 根据固定相 不同又可分为气固色谱法和气液色谱法 。LC 同样 可分为液固色谱法和液液色谱法 ,此外还有超临界 流体色谱法 。液液色谱法按固定相和流动相的极性 不同可分为正相 LC和反相 LC。正相 LC 采用极性固定相 ,流动相为相对非极性的疏水性溶剂 ,常用于 分离中等极性和极性较强的化合物 。反相 LC 一般 用非极性固定相 ,流动相为水或缓冲液 ,并常加入与 水互溶的有机溶剂以调节保留时间 ,适用于分离非 极性和极性较弱的化合物 。 GC 由于使用气体为流 动相 ,不能分析大多数金属盐类和热稳定性差的物质 ,对于此类物质的分析需要借助 LC ,尤其是高效 液相色谱法 18 。高效液相色谱 高效液相色谱法 ( h igh p e rfo rm 2 ance liqu id ch rom a tograp hy, H PLC ) 是以液体作为流 动相 ,并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术 。它是在传统 LC 的基础上 ,辅以高效固定相 、高压泵和高灵敏度检测器及计算机技术的应用 ,从而实现了液相色谱分析的高效 、高速 、高灵敏和自动 化操作 ,因此被称为 H PLC。它对样品的适用性广 , 不受分析对象挥发性和热稳定性的限制 ,适于分离分析沸点高 、热稳定性差 、分子量大的许多有机物和在 fmo l ( 10 - 15 ) 乃至 a ttomo le ( 10 - 18 ) 水平检测分子量高达几十万的生物大分子成为可 能 21 , 22 。在 蛋 白质组学中 ,目前最为常用的质谱分析系统包括两一些无机物 ,弥补了 GS的不足 。但是 H PLC的固定相的分离效率 、检测器的检测范围以及灵敏度等目 前还不如 GS,此外对于气体和易挥发物质的分析方GS 1820 。面也远不如大类 :以单一质谱为基础的和以串联质谱为基础的 。以单 一 质 谱 为 基 础 的 质 谱 分 析 系 统 以 MALD I2TO F M S为代表 。串联质谱以 ES I2M S M S为代表 ,常 用的多级质量分析器有 quad rupo le tim e2of2fligh t (Q 2TO F) 、trip le quad rupo le、四极杆 2飞行时间质量分析 器 ( quad rupo le2tim e of fligh t ana lyze r)等 。MALD I2TO F M S 基质辅助激光解吸附飞行时间 质 谱 ( m a trix a ssisted la se r de so rp tion ion iza tion / tim e2of2fligh t m a ss sp ec tro scop y, MALD I2TO F M S) 是 将作为离子源的 MALD I和分析检测的飞行时间质 谱连用 。MALD I的电离方式在 1988 年由 Ka ra s 和 H illenkamp 提出 。MALD I的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体 ,当用激光照射晶体时 , 基质分子吸收激光能量与样品解吸附 ,基质 2样品之 间发生电荷转移使样品分子电离 21 , 22 。然 后离 子 源中每一脉冲激光产生的离子 先经 过 一个 加速 电 场 ,获得动能 ,再进入一个高真空无电场飞行管道 ,离子在此无场飞行管道内以在加速电场获得的速度 飞行 。质量较轻的离子飞行速度快 ,较早到达检测 器 ,较重的离子飞行速度慢 ,较晚到达检测器 ,离子 的飞行时 间 与其 质荷 比 的平 方 根 (m / z) 1 /2 成 正 比 ,通过检测飞行时间来测定离子的质荷比 ,此即为TO F 21 , 22 。MALD I2TO F M S 常 用 于 蛋 白 质 的 肽 指 纹 图 谱 ( p ep tide m a ss finge rp rin ting, PM F ) 鉴定 。 PM F 是指 蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片 段质量图谱 。由于每种蛋白质的氨基酸序列不同 , 蛋白质被酶水解后 ,产生的肽片段序列也各不相同 , 其肽混合物质量数亦具特征性 ,所以称为指纹图谱 ( finge rp rin ting) 。将获取的指纹图谱在蛋白质数据 库中检索 ,寻找具有相似 PM F 的蛋白质 ,就可以初 步完成蛋白质的确认 21 , 23 。 2 2D 电泳凝胶上的蛋白 质可被原位酶切或转印到 PVD F膜上酶切获得肽混 合物 ,经质谱分析得到 PM F。MALD I2TO F M S的主要优点在于 : 操作较为 简便 。MALD I2TO F M S是在质谱技术中操作最简易 的一种 ; 在与 2 2D 凝胶电泳联用时 ,可以从样本的 获取至处理及上样 、分析均实现自动化 ,保证了实验 的精确性 ,并符合大通量分析的要求 ; 灵敏度高 ,多维液相分离系统液相色谱是蛋白质组学非凝胶蛋白分离技术中最常用的方法 ,除此之外还有 毛细管电 泳 ( cap illa ry e lec trop ho re sis, CE ) , 它 是 一 类以毛细管为分离通道 、以高压直流电场为驱动力 , 根据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差 异而实现分离的一类液相分离技术 19 。单一的液 相分离技术由于自身分离能力的限制 ,常不能满足 复杂蛋白质复合物分离的需要 ,多维液相分离系统 的建立促进了蛋白质组学的发展 。多维液相分离系 统是两种或两种以上具有不同分离原理特性的液相 分离方法的优化和组合 。由于多维液相分离系统的 总分辨率约等于各维平方和的平方根 ,总峰容量约 等于各维峰容量的乘积 ,多维液相分离系统有效地 提高了系统对样本的分辨率和峰容量 。此外多维液 相分离系统还具有快速 、高通量 、自动化 、重复性好 等优点 19 。常见的多维液相分离系统有二维色谱 ( 2D 2LC ) 、二维 毛 细管 电泳 ( 2D 2CE ) 、液 相色 谱 2毛 细管电泳 (LC 2CE ) 等 。其 中 2D 2LC 又包 括 二 维 离 子交换色谱 2体积排阻色谱 、二维离 子交 换色 谱 2反 向色谱 、二维体积排阻色谱 2反向色谱等 。色谱技术 除了直接对蛋白分离分析外 ,常与质谱技术联用 ,为 蛋 白 质 组 的 分 离 、分 析 和 鉴 定 提 供 了 有 力 的 平 台 6 , 7 , 1720 。质谱技术质谱技术的基本原理是样品分子离 子化后 ,根据不同离子间的荷质比 (m / e ) 的差异分 离并确定分子量 。一个完整的质谱分析系统由离子 源 ,质量分析器和检测器 3个部分组成 ,再辅以进样 系统和后续分析系统 6 , 21 。质量分析器是质谱的核 心元件 ,决定着质谱的准确度 、灵敏度和分辨率等 。 常用的质谱分析技术有以下四种 : 离子肼质谱 ( iron trap , IT) 、飞行 时间 质谱 ( tim e2of2fligh t, TO F ) 、四 极 杆质谱 ( quad rupo le, Q )和傅立叶变换离子回旋共振 质谱 ( fou rie r tran sfo rm ion cyc lo tron, FT ICR ) 。质 谱 技术能从复杂的样本中定性 、定量分析蛋白质 ,而新 的离子化技术则使质谱技术的灵敏度和准确度均有 了显著提高 ,尤其是基质辅助的激光解吸附 /离子化( m a trix2a ssisted la se r de so rp tion / ion iza tion, MALD I)和电喷雾离子化 ( e lec tro sp ray ion iza tion, ES I) , 使得可以检测出 10 - 18 mo l级的蛋白质 ; 精确度较高 ,并 随 着 TO F 的 改 进 而 使 精 确 度 得 到 更 好 保 证 2123 。固相支持物表面高度密集排列探针蛋白点阵 ,当待测蛋白与其反应时 ,可特异性地捕获样品中的靶蛋 白 ,然后通过检测系统对靶蛋白进行定性及定量分析 。其中最常用的探针蛋白是抗体 6 , 25 , 26 。现在伴随着标记技术和检测技术的进步及探针标记物的多 样化 ,蛋白质芯片技术已日益广泛地应用于蛋白质 组学的多个领域 。蛋白质芯片技术具有高效 、高通 量 、灵敏度高等优点 。蛋白质抗体芯片蛋白质抗体芯片是将能和不 同抗原特异性结合的多种抗体高密度地固定在玻片或其他载体上 ,使待测样品通过芯片表面 ,经过洗脱 把非特异性结合的蛋白洗掉 ,从而对特异性地结合在上面的抗原进行检测 26 。对结合抗原的检测可以通过质谱 、荧光 、显色等直接或间接地进行 。抗体 蛋白质芯片具有以下优点 : 特异性高 。这是由抗 原抗体之间的特异性结合决定的 ; 高通量 。在一 次实验中可同时检测多种蛋白 ,所需抗体量少 ,花费 少 ,检测时间短 ; 敏感性较高 ,可达到 ng /L 水平 ;可重复性好 ,不同次实验间相同两点之间变异小 于 10 % 。第一张商品化的抗体芯片由美国 BD C lon2 tech公司推出 ,芯片上排列了 378 种已知蛋白的单抗 ,新一代的芯片已超过 500 种 。这些单抗对应的ES I2M S M SES I是在质谱进样端的毛细管柱出口处施加一高电压 ,利用高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴 ,并在干燥或气流等 的作用下 ,使液滴崩解为大量带一个或多个电荷的 离子 ,最终使分析物离子化并以带单电荷或多电荷 离子的形 式进 入 质量 分析 器 22 。 ES I的 特 点 是 产 生高电荷离子而不是碎片离子 ,其所形成的多电荷 离子可以直接用来准确地和高灵敏度地确定多肽与蛋白质的分子量 。MALD I2TO F M S主要用于获取蛋白质或肽的质 量数据 ,串联质谱 ( tandem 2M S)则可完成肽的测序 。 蛋白质由 20种氨基酸组成 ,一段 3个氨基酸的肽有203 种可能排列方式 , 4 个氨基酸的肽有 204 种可能 排列 方 式 , 一 个 特 定 序 列 的 4 肽 出 现 的 概 率 为1 /160 000。所以 5、6 个氨基酸残基的序列片段在 一个蛋白质组中已具有很高的特异性 ,因此测出 N 端或 C 端 5 6 个氨基酸残基的序列可以用来鉴定蛋白质 。串联质谱 在第 一级 质 谱得 到肽 的 分子 离 子 ,选取目标肽的离 子 作为 母离 子 , 与惰 性 气体 碰 撞 ,使肽链中的肽键断裂 ,形成一系列离子 ,即 N 端 碎片离子系列和 C 端碎片离子系列 ,再将这些碎片 离子系列综合分析 ,得出肽段的氨基酸序列 1820 。将读出部分的氨基酸序列结合此段序列前后的离子 质量和肽段母离子质量 ,在数据库中查寻 ,即为肽序蛋白涉及信号传导 、肿瘤 、细胞周期调控 、细胞结构 、细胞凋亡和神经生物学等广泛的领域 。通过这张芯片 ,我们在一次实验中就能够了解几百种蛋白的表 26 达情况。SELD I2TO FM S 表面加强激光解吸电离飞行时 间质谱技术 ( su rface enhanced la se r de so rp tion / ion iza2 tion tim e2of2fligh t M S, SELD I2TO FM S) 实质上是一种 包含层析与质谱的特殊蛋白质芯片技术 。 SELD I蛋 白质芯片根据芯片表面的成分 ,可分为化学表面芯 片和生物表面芯片 。其中化学表面芯片又可分为疏 水 、亲水 、阳离子 、阴离子和金属离子螯合芯片五种 ; 而生 物 表 面 芯 片 又 分 为 抗 体 2抗 原 、受 体 2配 体 和 DNA 2蛋白质芯片等种类 。蛋白质样本首先通过亲 合作用结合到芯片的化学或生物位点上 ,在洗去非 特异结合后 ,加入的能量分子与蛋白形成晶体 ,然后 通过激光解吸附电离 。电离的蛋白质通过 TO F 被 测出质量 ,最后可以得到一个整体的结合蛋白的质 谱图 。 SELD I2TO FM S技 术 的主 要特 色 是能 够直 接 自未经处理的生物样品获取蛋白质图谱 17 , 18 , 27 。 24 ,或者直列标签技术 ( p ep tide sequence tag, PST)接用 串 联 质 谱 数 据 进 行 检 索 。相 对 于 MALD I2TO F M S常和 2 2D 凝胶电泳联用而言 , ES I2M S M S常 和 LC联用 19 。 ES I2M S M S可检测出 fmo l数量极的样品 ,检测精确度可达 01005 % 。 ES I2M S M S还可以 检测分子量超过 200 KD 的蛋白质 , 不过当分子质 量超过 100 KD 时 , 由于多电荷峰难以分辨而使分 析非常复杂 。事实上 ,随着 MALD I2TO F M S技术的改进和精度的提高 , 部 分 肽 序 列 测 序 也 可 由 MALD I2TO F M S 完成 。比如 :近年来采用的源后衰变 2基质辅助激光 解吸离子化质谱 ( po st2sou rce decay MALD IM S, PSD 2MALD IM S)技术可以测得肽序列 23 。 蛋白质芯片技术蛋白质组学研究的另一重要技术是蛋白质芯片技术 ( p ro te in m ic roa rray) ,它是在聚焦显微镜 、流式细胞仪等检测方法的联用不但使对活体细胞进行细胞定位成为可能 ,更可通过观察 蛋白的细胞共定位研究蛋白质 2蛋白质间相互作用 , 蛋白质组学也因此得到了日益广泛的应用 30 。荧光蛋白融合技术荧光蛋白是一类具有发光功能的 蛋 白 质 , 以 绿 色 荧 光 蛋 白 ( green fluo re scen t p ro te in, GFP)为代表 ,此外还有红色荧光蛋白 、蓝色 荧光蛋白等等 。 GFP 是一类存在于水母 、水螅和珊 瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白 ,由 238 个氨基 酸残基组成 ,分子量为 27 kD ,可以在紫外或蓝光的 激发下显示出绿色荧光 31 。 GFP 与外源基因偶联 时一般不影响外源蛋白的结构和功能 ,并可在活细 胞内长时间存在 ,其荧光强度与蛋白量正相关 。因 此 GFP与蛋白偶联后 ,可以在活细胞或生物体内动 态观察目标蛋白质的表达 、分布 、变化 ,并进而探讨 其生物学效应 。如果将两种或两种以上蛋白分别构 建荧光定位载体 ,然后转染入细胞 ,观察它们单独存 在和共同存在时的表达分布 ,就可知这两种或多种 蛋白是否存在细胞共定位 。荧光蛋白融合技术操作 简便 ,便于动态观察 。但是由于观察的融合蛋白是 外源性导入 ,有可能与在生理条件下的分布 、变化有 差异 ,此时可以运用免疫荧光技术确定内源表达蛋 白的定位 。免疫荧光技术 免疫荧光技术 ( imm unofluo re s2 cence)是根据抗原抗体反应的原理 ,先将已知的抗 原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物 ,再用这种 荧光抗体 (或抗原 ) 作为分子探针检查细胞或组织 内的相应抗原 (或抗体 ) 。抗原抗体结合后 ,免疫复 合物由于带有荧光标记 ,可以在荧光显微镜下被发研究蛋白质相互作用的技术蛋白质在生命活动中彼此协调和控制 ,它们之间的相互作用不仅参与和调控基因转录 、细胞分裂 增殖 、信号转导 、代谢等重要生命活动 ,同时还与疾病的发生 、发展密切相关 。认识和了解蛋白质之间 的相互作 用 , 建立 基 因组 蛋白 连 锁 图 ( genom e p ro2 te in linkage m ap )和蛋白作用网络图 ,对于认识生命 活动有着重要意义 。酵母双杂交系统酵母双杂交系统 ( yea st two2hyb rid system )是 作 为发 现和 研 究活 细胞 体 内蛋 白 质与蛋白质之间的相互作用而建立的技术平台 。酵 母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起 始过程的认识 。众所周知 ,细胞起始基因转录需要 有反式转录激活因子的参与 。由此将反式转录激活因子 如 酵 母 转 录 因 子 GAL4 的 DNA 结 合 功 能 域 (DNA b ind ing dom a in, DNA 2BD )和转录激活结构域 ( ac tiva tion dom a in, DNA 2AD )分开 ,分别构建两个质粒 ,其中将 DNA 2BD 与作为“诱饵蛋白 ”( ba it) 的已 知蛋白质构建在同一个表达载体上 ,而 DNA 2AD 和称为“猎物蛋白 ”( p rey) 的待检蛋白构建于另一表 达载体 。将两个质 粒同 时转 入 带有 报告 基 因的 酵 母 。只有当连着 DNA 2AD 的“猎物蛋白 ”能够与连 着 DNA 2BD 的 “诱 饵 蛋 白 ”结 合 时 , DNA 2AD 和 DNA 2BD 才能结合发挥反式转录激活因子的作用 ,启动报告基因的表达 。反之 ,当检测出报告基因的 表达 ,就说明“猎物蛋白 ”能够与“诱饵蛋白 ”相互发 生作用 。酵母双杂交系统不仅可用于验证两个已知 蛋白间的相互作用或找寻它们相互作用的结构域 , 还可以用来从 cDNA 文库中筛选与已知蛋白作用的 蛋白基因 。由酵母双杂交系统衍生的酵母单杂交系统 、酵母三杂交系统和反向双杂交系统等使这一技 术得到了更广泛的应用 6 , 28 。大规模酵母双杂交系 统如酵母双杂交系统芯片的建立为蛋白质组学研究 提供了支持 29 。细胞共定位技术不同的蛋白质具有不同的细胞定位 ,并可能随着生理和病理生理的改变而改变 。 蛋白在细胞内的定位对于蛋白之间的相互作用和它 们的生物学功能具有重要意义 。传统的细胞定位技 术 ,如 :蛋白亲和色谱 、免疫共沉淀技术 、细胞组分分 离及免疫印迹技术等主要适用于非活体细胞的蛋白 定位 ,荧光蛋白融合 、免疫荧光等新技术的建立及共现 。免疫荧 光技 术 分为 直接 法 、间 接法 和补 体 法 。以不同的荧光素标记不同的蛋白可以同时观察两种或两种以上蛋白的分布情况 ,包括它们的共同定位 分布 。荧光技术与共聚焦显微镜的结合使用能更加有 效地实现细胞定位 30 。共聚焦激光扫描显微镜的 共焦系统是利用点光源代替了传统光学显微镜的场光源 ,使探测点和照明点共轭 ,从而有效地抑制了同 一焦平面上测量点的杂散荧光 ,同时亦可抑制来自 样品非焦平面的荧光 ,由此可获得生物样品的高反 差 、高分辨率和高灵敏度的二维图像 。共聚焦激光 扫描显微镜同时还具备纵向分辨能力 ,可对细胞及组织进行无损伤光学切片 ,获得样品的系列光学切片及样品中不同深度 、不同层面的信息 ,然后通过其三维重建和三维显示功能 ,可以显示样本的空间结 构和蛋白的空间定位 30 。生物信息学多根本性的进步 ,但它也有很多不完善和局限的地方 。比如应用 2 2D 凝胶电泳进行蛋白质组学分析 时 ,就有可能检测不出低丰度蛋白 、跨膜和膜相关的蛋白质 ,而这些蛋白在蛋白转运和信号转导等许多生物学作用中有重要意义 ,这时候传统的免疫学方 法就能发挥有效的 作用 4 。蛋 白质 组 学主 要适 用于大批量的研究和生物标记物 ( b iom a rk)的搜寻 ,以 及获取细胞 、组织或器官整体表达的数据 。简言之 ,生物信息学 ( b io info rm a tic s)是生物科学与计算机科学以及应用数学等多门学科相互交叉而形成的 一门新兴学科 。它将大量系统的生物学数据与数学 和计算机科学的分析理论和实用工具联系起来 ,通 过对生物学实验数据的获取 、加工 、存储 、检索与分析 ,达到解释数据所蕴含的生物学意义的目的 。生 物信息学平台一般由数据库 、计算机网络和应用分 析软件三大部分组成 。数据库的建立使不论基因组 还是蛋白质组学研究产生的大量惊人数据从输入 、 储存 、加工至调取获得迅速 、有效的控制 ; 而计算机网络实现了数据库之间的联系和数据的全球化 ; 应 用分析软件不仅可对大规模的已知数据进行分析 , 如序列相似性分析 、电泳成象及图谱分析等 ,还可以 以已知数据为基础对未知数据进行预测 ,如蛋白质 功能预测 、结构预测等 。目前全球已建立了许多与蛋白质相关的数据库 ,如 : P IR 国际蛋白质序列数据 库 ( h ttp: / /p ir1 geo rge town. edu ) 、SW ISS2PRO T ( h t2 tp: / /www. eb i. ac. uk / sw issp ro t) 、PRO S ITE ( h ttp: / / www. exp a sy. ch /p ro site)等等 ,为蛋白质组学研究提 供了有利条件 32 。生物信息学伴随着生命科学的发展而发展 ,其 数据库建立和应用软件开发日益成熟 ,已广泛应用 于包括蛋白质组学在内的生物研究各领域 ,同时蛋 白质组学等研究的完成也依赖 于生 物信 息 学的 辅 助 。比如 , 2 2D 凝胶电泳后首先通过图象成象和图 象处理 ,获得 2 2D 电泳图 ;然后既可以直接通过网络进入 2 2D 电泳图库进行检索 ,也可以通过分析软件 获取不同生理或病理生理条件下蛋白电泳图的改变 及改变蛋白点的参考 p I和分子量 ; 如果要对某些蛋 白点进行进一步鉴定 ,将相应蛋白点切割 、消化后接 着以质谱分析 ,质谱分析的结果首先以应用软件分析处理 ,然后不论是“肽指纹图谱 ”还是“肽序列标 签 ”,都必须进入相应数据库检索 ,才能获得所需蛋 白质鉴定资料 ;之后如果需要进行更深入的功能研 究 ,还可利用数据库和应用分析软件对进行二级结 构预测 、功能预测等等 。虽然蛋白质组学较传统的蛋白质研究方法有很蛋白质组学是高通量的分析 ,是对传统方法的补充 。通常我们把蛋白质组学分析视为一个扫描工具 ,用以产生一系列的“候选者 ”,再以传统的方法进行更 深入的研究和功能分析 。蛋白质组延续基因组发展而来并与之对应 ,但 是又有着不同之处 : 一个生命体只有一个确定的基因组 ,为组成该机体的所有细胞共有 ;而蛋白质组则 是一个动态的概念 ,它不仅在同一个机体的不同组织和细胞中不同 ,在同一机体的不同发育阶段 、不同 的生理条件或疾病状态下都是不同的 。正是这种复 杂的表达模式 ,构成了生命活动的复杂性和多样性 ,也正是这种复杂的生命现象带给了我们无穷挑战和契机 。对于蛋白质组学技术方法的了解和掌握无疑 将赋予我们更具开拓性研究的利器 。参考文献W itzm ann F, C lack J , Fu ltz C, et a l. Two2d im en siona l e lec trop ho retic m app ing of hep a tic and renal stre ss p ro te in s. E lec trop ho resis, 1995 ,16: 451Peng J , Gygi SP. P ro teom ic s: the move to m ixtu re s. J M a ss Sp ec2trom , 2001 , 36: 1083V isith Thongboonke rd. P ro teom ics in nep h ro logy: cu rren t sta tu s and fu tu re d irec tion s. Am J N ep h ro l, 2004 , 24: 360Krepp e r MA. P ro teom ic s and the Kidney. J Am Soc N ep h ro l, 2002 ,13: 1398Hono re B , O stergaa rd M , Vo rum H. Functiona l genom ic s stud ied by p ro teom ic s. B ioe ssays, 2004 , 26: 901de Hoog CL , M ann M. P ro teom ic s. A nnu R ev Genom ic s H um Gen2e t, 2004 , 5: 267Cu tilla s P, B u rlingam e A , U nw in R. P ro teom ic stra tegie s and their app lica tion in stud ie s of rena l func tion. N ew s Physio l Sc i, 2004 , 19:114H ew itt SM , D ea r J , Sta r RA. D iscove ry of P ro tein B iom a rke rs fo r R e2na l D isea se s. J Am Soc N ep h ro l, 2004 , 15: 1677O Farre ll PH. H igh reso lu tion two2d im en siona l e letrop ho re sis of p ro2te in s. J B io l Chem , 1975 , 250: 400712345678910 Klo se J , Koba lz U. Two d im ersiona l ele trop ho re sis of p ro te in s: an up 2dated p ro teoco l and imp lica tion s fo r a function ana lysis of the genom e. E lectrop ho re sis, 1995 , 16: 103411 Mo lloy M P. Two d im e rsiona l e le trop ho re sis of m em b rane p ro te in s u2sing immob ilized pH grad ien ts. A na l B iochem , 2000 , 280: 112 Fey SJ , L a rsen PM. 2D o r no t 2D. Two2d im en siona l ge l e lectrop ho re2sis. Cu rr Op in Chem B io l, 2001 , 5: 2613 Klein E, Kle in JB , Thongboonke rd V. Two2d im en siona l ge l e lec tro2 p ho resis: a fundam en ta l too l fo r exp re ssion p ro teom ics stud ie s. Con t2 rib N ep h ro l, 2004 , 141: 2514 Gio rgiann i F, D e side rio DM , B e ranova2Gio rgiann i S. P ro teom e analy2 sis u sing isoe lec tric focu sing in immob ilized pH grad ien t ge ls fo llowed by m a ss sp ec trom e try. E lec trop ho resis, 2003 , 24: 25315 Go rg A , W e issW , D unn MJ. Cu rren t two2d im en siona l e lec trop ho re sistechno logy fo r p ro teom ics. P ro teom ic s, 2004 , 4 ( 12 ) : 366516 Chang J , R emm en HV , W ard W F, et a l. E lectrop ho re sis fo r Sta tisti2 ca l A nalysis: M issing D a ta, No rm a liza tion, and Statistic s. J P ro teom e R e s. 2004 , 3: 121017 John M. A rthu r. P ro teom ics. Cu rr Op in N ep h ro l H yp e rten s, 2003 ,12: 42318 Voge se r M. L iqu id ch rom a tograp hy2tandem m a ss sp ectrom e try app lica tion in the c lin ica l labo ra to ry. C lin Chem L ab M ed, 2003 , 41:11719 Sm yth W F, B rook s P. A c ritical eva lua tion of h igh p erfo rm ance liqu id ch rom a tograp hy2e lec tro sp ray ion isa tion2m a ss sp ec trom e try and cap il2 la ry e lec trop ho resis2e lectro sp ray2m ass sp ec trom e try fo r the de tection and de term ina tion of sm a ll mo lecu les of sign ificance in c lin ica l and fo2 ren sic sc ience. E lec trop ho resis, 2004 , 25: 141320 Takaha sh i N , Kaji H , Yanagida M , et a l. P ro teom ic s: advanced tech2no logy fo r the analysis of ce llu la r func tion. J N u tr, 2003 , 133: 2090 S21 L im M S, E len itoba2John son KS. P ro teom ic s in p a tho logy re sea r