芦丁的提取分离及鉴定预习报告.doc

天然药物化学实验预习报告题目：芦丁的提取分离及鉴定目录第一章 前言 2 1.1 芦丁的介绍 . 21.2 芦丁的作用 2 1.3 芦丁的提取纯化方法 31.3.1 （热）碱提取酸沉淀法 31.3.2 热水提取法 31.3.3 乙醇浸提法 31.3.3 乙醇浸提法 31.3.4 连续回流提取法 31.3.5 超声辐射法31.3.6 大孔树脂提取法 41.3.7 微波法提取51.3.8 酶法提取5 1.3.9 超临界流体萃取法51.2 芦丁提取的研究及意义5第二章 实验部分 7 2.1 材料. 7 2.1.1 原料 72.1.2 药品和试剂 72.1.3 实验仪器 72.2 实验原理 7 2.2.1 芦丁的提取原理 72.2.2 芦丁的分离提纯原理 7 2.2.3 芦丁的鉴定原理 72.3 实验流程 72.4 实验操作 82.4.1 芦丁的提取与提纯 82.4.2 芦丁的鉴定8 第一章 前言1.1 芦丁的介绍 芦丁(Rutin)广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。以槐花米(为植物槐SopHora japonica L.的未开放的花蕾)和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由槲皮素(Quercein)3位上的羟基与芸香糖脱水缩合形成的甙，故又叫芸香甙(芸香糖Rutinose是L-鼠李糖-1-6L-葡萄糖)，其结构如下：C27H30O163H2O=664.6芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶。三分子结晶水合物m.p. 174178，无水物m.p. 180190。溶解度： 水 0.0013%(冷)，0.55%(热)； 甲醇 1.0%(冷)，11.2%(热)； 乙醇 0.36%(冷)，3.5%(热)； 吡啶 8.5%(冷)，易溶(热)。易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸和浓盐酸，呈深黄色，加水稀释复析出，微溶于丙酮、醋酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚。1.2 芦丁的作用芦丁既可作为治疗药物，又可作为保健品。芦丁具有维生素P样作用，能降低毛细血管通透性和脆性，促进细胞增生和防止血细胞凝聚，以及抗炎、抗过敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂等。临床上芦丁主要用于高血压病的辅助治疗和用于防治因芦丁缺乏所致的其它出血症，如防治脑血管出血、高血压、视网膜出血、紫癜、急性出血性肾炎、慢性气管炎、血液渗透压不正常、恢复毛细血管弹性等症，同时还用于预防和治疗糖尿病及合并高血脂症。目前主要用于治疗毛细血管的脆性和渗透性出血，降低人体血脂和胆固醇，是治疗高血压、心血管疾病、胃病、皮肤病、糖尿病等多种疾病的良药。此外它还有抗菌和抗辐射作用。芦丁可以直接作为药品，也用于复配和药物的中间体。国外主要用于食品、化妆品的添加剂和着色剂。也正是由于芦丁的这些治疗和预防作用，人们常用富含芦丁的药食两用植物苦荞等作保健品。芦丁的其它用途。在食品工业中芦丁还可作抗氧剂和天然食用黄色素。在化妆品行业，因芦丁对紫外线有较强的吸收作用，能吸收A 区（波长320400nm）紫外线，所以芦丁常单用或与黄芩苷能吸收B 区（波长280320nm）紫外线合用，作防晒霜的主要成分，远比以往使用的一些合成防晒剂（如一些油溶性的品种对皮肤有局部刺激性）好得多，是目前较为理想的一种天然广谱防晒剂。1.3 芦丁的提取纯化方法1.3.1 （热）碱提取酸沉淀法槐米加约6倍量的水, 煮沸, 在搅拌下慢慢加入石灰乳至pH 8 9, 在此pH 条件下微沸0. 5 h, 趁热抽滤。残渣再加4倍的水煎一次, 趁热抽滤, 合并滤液, 取滤液加入浓盐酸至pH 为5 , 搅拌静置24 h后抽滤。用水洗至中性, 用沸水重结晶得芦丁醇品。注意所用的碱液浓度不宜过高, 以免破坏黄酮母核。在加酸酸化的时候, 酸也不宜过强, 以免生成钖盐,致使生成的黄酮类化合物又重新溶解, 降低芦丁的产率 。1.3.2 热水提取法利用芦丁在冷热水、甲醇、乙醇中的溶解性差别大, 以槐米为原料, 加5 倍的水回流加热0. 5 h, 过滤, 取滤液冷却后析出晶体, 抽滤后干燥。再用无水乙醇除杂过滤, 加适量水后蒸出乙醇, 冷却后析出芦丁。这种方法简单易行, 造价较低, 但是由于加热,所以会有一定的水解产物产生, 芦丁的产率较低。1.3.3 乙醇浸提法取槐米加入无水乙醇加热回流, 取得芦丁。此方法较热水提取法、碱提酸取沉淀法比较简单, 无毒害作用, 是一个比较有效的方法, 醇提的收率高, 还可以回收试剂, 有利于环境保护。有报道以95%(质量分数)乙醇连续回流提取至提取液无色, 回收乙醇至干得粗膏, 除去脂溶性杂质后可使芦丁的收率达21. 13%, 纯度达到95. 13% , 并能使相对收率达79. 9% , 比酸碱法中芦丁的收率、纯度和相对收率均提高。但是由于醇提需要大量有机溶剂, 提高了生产成本。1.3.4 连续回流提取法连续回流提取法采用乙醇作溶剂, 提取用溶剂量少, 溶剂回收利用率高, 可自动平衡渗出度和回流液的流速及流量。提取结束后可直接回收溶剂, 此方法还有使用简单, 节省时间的效果 。1.3.5 超声辐射法超声波提取技术是近年来应用于中草药有效成分提取分离中的一种手段。原理是利用超声波的空化作用加速植物有效成分溶出, 另外超声波次级效应, 如机械震动乳化、扩散、击碎、化学效应等, 也能加速提取成分的扩散、释放与溶剂充分混合而利于提取。超声波提取法最大的优点是提取时间短、温度较低、收率高, 并且可以为中药大生产的提取分离提供合理化生产工艺、流程及参数。超声波在有机物降解和天然物的有效成分提取等方面已有了一定的应用。超声波作用可以激活某些酶与细胞参与的生理生化过程, 从而提高酶的活性, 加速细胞新陈代谢过程。超声波的热效应, 机械作用, 空化效应是相互关联的, 通过控制超声波的频率与强度可突出其中某一作用, 减小或消除另一个作用, 以达到提高有效成分提取率的目的。用质量分数为70%的乙醇浸泡芦丁12 h, 用频率为20 kH z的超声波从槐米中提取芦丁, 处理30 min, 提取后, 只需用酸沉放置0. 5 h, 大大缩短提取时间, 效率较高。从而避免了水提对原料的大量浪费, 提高了原材料的利用率。1.3.6 大孔树脂提取法大孔树脂是一类有机高聚物吸附剂, 是一种非凝胶型、有致孔剂、不含交换基团、有含空隙结构的纯聚合物。其平均孔径在3 10 nm, 具有比表面积大、吸附容量大、选择性好、再生处理方便、吸附速度快等特点。大孔树脂提取芦丁, 既达到其质量标准又降低了成本。将槐米用65% (质量分数, 下同)乙醇回流提取, 减压浓缩, 加ZTC 澄清剂水沉降后,再将水沉降液上大孔树脂柱, 用pH = 5 6倍量水洗涤, pH = 3 的25% 7. 5 倍量乙醇洗涤, 然后用70% 乙醇洗脱、减压浓缩、喷雾干燥得到淡黄色的槐米提取物, 其黄酮质量分数稳定在26% 以上,ADS217、ADS221、ADS2 F8 等大孔树脂, 使芦丁生产具有更大的灵活性, 其中ADS217 对黄酮类化合物具有很好的选择性, 应用大孔树脂提取其他植物总黄酮也多有报道, 使用也比较广泛。1.3.7 微波法提取取槐米加入大于槐米体积16倍的85%质量分数乙醇, 置于微波炉中大火提取, 提取率可达16%。影响微波提取的最主要因素为乙醇浓度 。 1.3.8 酶法提取 酶技术应用于中草药有效成分的分离提取取得了不少新的成果, 尤其应用纤维素酶可破坏细胞壁的致密结构, 加速药用有效成分的溶出, 提高药用有效成分的提取率。酶解过程的实质是通过酶解反应促进传质过程。以纤维素酶、果胶酶组成的复合酶,在40, pH 5 10 的条件下酶解3 h 提取率达16%, 与微波法提取率相当 15 。酶法提取与微波法提取相比, 提取成本低, 耗能低, 为提取芦丁提供了一种新方法。1.3.9 超临界流体萃取法SFE是引进的一种新型提取分离技术, 它利用一种以超临界流体( SCF )如二氧化碳、乙烯、丙烷、丙烯、水等在临界点附近某区域内, 与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性, 且对溶质的溶解能力随着压力和温度的改变在相当宽的范围内变动, 这种流体可以是单一的, 也可是复合的。添加适的夹带剂可大大增加其溶解性和选择性。将槐米装入萃取器中, 装完后立即抽真空达到脱氧的目的, 萃取在适宜的压力温度和二氧化碳的条件下, 进行萃取, 然后进行分离。由于二氧化碳的无毒、不易燃易爆又特廉价的原因, 具有广泛的应用。1.2 芦丁提取的研究及意义 随着人们生活水平的不断提高, 心脑血管疾病的发病率也呈上升趋势, 而且其死亡率居各种疾病之首, 因此对治疗和预防心脑血管疾病的药品与保健品的开发研究就显得尤为重要 。黄酮类化合物在心脑血管疾病的治疗上起到了举足轻重的作用。其中芦丁是研究比较多的一种, 是其中的一个典型代表。芦丁具有维生素P样作用，有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，用于治疗毛细血管脆弱引起的出血病，并用作高血压的辅助治疗剂(但不能降压)。其甙元槲皮素则具有抗炎及止咳祛痰作用，用于治疗支气管炎。此外，以芦丁为原料经半合成可制得羟乙基芦丁(Troxerutin;Trioxyethylrutin,Venoruton)又叫维脑路通，能抑制血小板的凝集，防止血栓形成，增加毛细血管抵抗力，降低毛细血管通透性，防止血管通透性升高引起的水肿，是一种较好的治疗闭塞性脑血管病的药物，并可用于治疗静脉曲张、静脉炎等疾病。其结构如下： 此外，芦丁能凉血止血，清肝泻火具抗炎作用；芦丁具有抗病毒作用；芦丁还具有抑制醛糖还原酶作用。芦丁用于预防脑溢血、高血压、视网膜出血、急性出血肾炎、治疗慢性气管炎，对糖尿病型白内障也有较好的治疗。芦丁对紫外线具有较强的吸收作用，在化妆品中添加10%的芦丁，紫外线的吸收率在98%以上。第二章 实验部分2.1 材料 2.1.1 原料 槐花米2.1.4 药品和试剂 氧化钙 浓盐酸 10%NaOH 乙醇 镁粉 2%二氯氧锆甲醇液 浓硫酸10%-萘酚乙醇溶液 Ba(OH)2细粉 葡萄糖、鼠李糖标准品液 正丁醇醋酸 邻苯二甲酸苯胺 三氯化铝试剂2.1.5 实验仪器大烧杯1000ml，电热炉，研磨，玻璃棒，滴管，布氏漏斗，抽滤甁，抽滤机离心机，PH试纸，2.2实验原理 2.2.1 芦丁的提取原理 芦丁的提取利用芦丁为双糖黄酮苷，结构中含有多个酚羟基，能在碱溶液中溶解，可用碱性溶液进行提取，提取液加酸后可沉淀析出的性质。而且 槐花米中的其他成分如白桦脂醇、槐二醇、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等无酚羟基,与槐花米中的多糖类一样,不溶于碱液,故用碱提酸沉法将芦丁从其他成分及杂质中很好地提取并分离出来,因此,碱提酸沉法在提取芦丁等含酚羟基较多的黄酮类化合物时较其他方法高效、便捷槐花米中芦丁的提取可选用碱提pH 9 、酸沉pH 2 的酸碱度。然后进行重结晶后可以得到较纯的芦丁。用碱性较强的饱和石灰水作溶剂，有利于芦丁的成盐溶解。选用硼砂缓冲饱和石灰水的碱性可保护芦丁的黄酮母核不受破坏。用亚硫酸氢油为抗氧剂可保护芦丁的邻二酚羟基。芦丁是3 ， 3 ， 4 ， 5 ， 7 ， -五羟基黄酮-3-0-芸香糖式，它与芸香酶共存于槐米中，在洗涤、提取过程中受芸香酶作用而发生水解。它具有4 个酚羟基而显弱酸性。用碱性较强的溶剂提取时邻位的2 个酚羟基易被氧化，特别是在强碱存在时加热- 吡喃酮环会开裂.而在酸性较强的水溶液中它易生成钅羊 盐发生溶解，遇强酸则水解生成櫆皮素和芸香糖。 2.2.2 芦丁的分离提纯原理芦丁的分离提纯是利用芦丁在冷乙醇中溶解度小，在热乙醇中溶解度大，在冷水中溶解度小，在热水中溶解度大的性质进行分分离。芦丁用溶剂加热溶解后，趁热抽滤，滤液放冷后能析出沉淀而达到分离目的。 2.2.3 芦丁的鉴定原理 芦丁的鉴定是通过专属的化学显色反应，确定芦丁的成分类型。2.3 实验流程槐花米粗粉(20g)沸水400ml加石灰乳调pH89，煮沸30min趁热过滤(用棉花抽滤)药液(碱性) 药渣 60浓HCl调pH45放置 离心分离沉淀 加120ml水,加10%NaOH调pH89 加热至沸,趁热抽滤滤液 加20%HCl调pH45放置液 抽滤或离心精品 拿出1gH+H2O 沉淀(甙元)Ba(OH)2水解30min样品 抽滤 沉淀(BaSO4)pH=57 水解母液(取出20ml) 过滤 滤液 纸层析2.4 实验操作 2.4.1 芦丁的提取与提纯 称20g槐花米于研钵中研碎，加400ml水加热煮沸，在搅拌下加入石灰乳(约11.5g氧化钙加水使成饱和液)调pH89，煮沸30分钟(注意维持pH89)，趁热抽滤。滤液在6070用浓盐酸调至pH45，静置，析出大量的絮状沉淀，离心，得浅黄色的沉淀。往沉淀中加120ml蒸馏水，再加10%NaOH调pH89，加热至沸,趁热抽滤，滤液加20%HCl，调pH45，放置冷却后得到沉淀，抽滤或离心，得淡黄色粉末状结晶，即为芦丁精品，6070下干燥，称重、计算收率、测熔点。注意：1加入石灰乳可以使芦丁成盐溶于水，同时沉淀除去槐花米中含的大量多糖类粘液质。若过量，pH过高，则钙与芦丁形成螯合物析出沉淀；第一次过滤时，因含杂质较多，故应用棉花代替滤纸进行过滤。2若pH过低，芦丁易形成钅羊 盐降低收率。3利用芦丁在冷热水中溶解度差异进行重结晶，故需将得到的沉淀粗称一下，按照芦丁在热水中1：200的溶解度加蒸馏水进行重结晶。2.4.2 芦丁的鉴定1、定性反应：取芦丁34mg，加乙醇56ml使溶，分成3份做下述试验：（1）盐酸镁粉试验取上述供试液2ml，加2滴浓盐酸，再酌加少许镁粉，必要时可水浴加热，溶液由黄色渐变为红色者表示有黄酮类化合物。（2）锆柠檬酸反应取上述供试液12ml，滴加2%二氯氧锆甲醇液34滴，注意观察颜色变化情况。凡有5-或3-羟基的酮即为鲜黄色；然后再加2%柠檬酸甲醇溶液34滴，黄色不褪示为3-羟基黄酮，黄色变浅或褪去为5-羟基黄酮。（3）莫氏(Molish)反应取上述供试液12ml，加等体积的10%-萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸0.51ml左右，静置，观察两液层界面颜色变化。出现紫红色环者为阳性反应，提示试样分子中含有糖的结构。糖和甙类均呈阳性反应，比较槲皮素与芸香甙的不同。2、芦丁的水解，糖与甙元的鉴定芦丁的水解精密称取芦丁1g(0.01g)，加1%硫酸100ml，加热40分钟，放冷静置过滤。所得沉淀用少量水洗出酸，干燥称量，计算甙元与糖的重量比。然后再用乙醇(95%,约10ml)重结晶即得甙元。母液可供作糖的纸层析鉴定。注：干燥称重得甙元0.5g，其含2分子结晶水。若按照甙元与糖的比例为12时，应得甙元的理论值为0.5086g，若在9597之间干燥则得脱水甙元，脱水甙元的理论值为0.454g。糖的鉴定将水解所得水解母液10ml缓缓用Ba(OH)2细粉(约11.5g)中和至中性，滤出生成的BaSO4沉淀，滤液小心浓缩至12ml(注意防止炭化)，取样品液，葡萄糖、鼠李糖标准品液点于层析滤纸上，佐证法检出水解母液中所含糖的种类，纸层析条件如下，溶剂系统：BAW溶剂系统，即正丁醇醋酸水(415)，将此三种溶剂按比例混合，置分液漏斗中振摇，静置24小时，