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第五章常用生物化学检验技术 第一节光谱分析技术第二节电化学分析第三节电泳技术第四节层析技术第五节自动生化分析技术 光谱分析技术是根据物质吸收或发射辐射能而建立起来的一类分析方法 因不同分子的原子和原子团 其发射光谱和吸收光谱不同 而相同的物质在一定条件下 其发射光谱和吸收光谱的强度与该物质的含量成正比关系 因此可对物质进行定性和定量分析 此类技术称为光谱分析技术 光谱分析技术是一种最常用的生化检验技术 它主要包括 吸收光谱分析 可见 紫外 红外分光光度法和原子吸收分光光度法散射光谱分析 散射比浊法和透射比浊法发射光谱分析 火焰光度法 原子发射光谱法和荧光光谱法 光是一种高速传播的电磁波 光的波长 的常用单位是纳米 nm 可见光波长400 760nm 400nm称为紫外光 760nm称为红外光 波长愈短 能量愈大 可见 紫外吸收光谱是由于多原子分子的价电子在电磁辐射的作用下 由基态跃迁到激发态 这种因物质分子对辐射能的选择性吸收而得到的光谱称为吸收光谱 第一节吸收光谱分析 吸收光谱分析法包括可见 紫外 红外和原子吸收分析法 其中最常用的是可见光分析法 也被不严格地称为比色分析法 准确的名称应是可见光分光光度法 用于比色分析的光源与被测溶液的颜色应为互补色 可见 紫外吸收光谱用于定量分析的依据是光吸收定律 即Lambert Beer定律 它是吸收光谱法的基本定律 一 Lambert Beer定律1 Lambert定律当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后 由于溶液吸收了一部分光 则透过的光线为It 当溶液浓度不变时 透过的液层愈厚 则光线强度的减弱愈显著 It I0 用数学式表示为 透光度随溶液厚度增加而减少 其关系是透光度的负对数 lgT 吸光度A 与溶液厚度成正比 即 2 Beer定律当一束强度为Io的单色光透过某种吸光溶液后 若液层厚度不变 而浓度不同时 溶液的浓度愈大 则透过光的强度愈弱 其定量关系A K C 当液层厚度不变时 吸光度与溶液浓度成正比 这就是Beer定律 3 Lambert Beer定律合并Lambert定律与Beer定律可得A K L C说明吸光物质对单色光吸收的强度与物质的浓度和液层厚度成正比 吸光系数K的物理意义是吸光物质在单位浓度及单位厚度时的吸光度 在给定条件下 波长 溶液性质 浓度 吸光系数是物质的特征常数 K值愈大 能测定的浓度C愈小 则灵敏度愈高 二 比色分析仪器即可见光分光光度计 各类分光光度计的结构和原理基本相同 一般包括光源 单色器 吸收池 检测器和显色器五大部分 1 光源可见光常用钨灯 现用卤钨灯 紫外光常用氢灯 2 单色器可用滤光片 棱镜 光栅 3 吸收池 比色杯 4 检测器光电管或光电倍增管5 显示器指针式或数字式 三 比色分析的特点1 灵敏度高被测定物质的最低浓度一般为10 5 10 6mol L 2 测定快速 简便 3 应用范围广一些无色物质在一定条件下与显色剂反应 可生成有色物质 四 比色分析的定量方法 一 对比法又称标准对比法 通常在测定未知浓度样品的同时 测定一已知浓度的标准液作比较 然后分别测定两者的吸光度 AS KLSCSAR KLRCR 因测定成分相同 故K值相同 比色时用同样规格的比色皿故LS LR 所以比色分析中测定标准液与未知液吸光度的比值也就等于其浓度的比值 即若标准液与样品用量不等时 则再乘 用对比法进行定量时 为了减少误差 选用标准液浓度应尽可能接近待测样品浓度 二 标准曲线法配制一系列浓度不同的标准液 按一定操作方法显色后 用选定的波长分别测定它们的吸光度 然后以吸光度为纵坐标 标准液浓度为横坐标 在坐标纸上标出各坐标点 通过连接各点 使其成一直线 即A C曲线 注意事项1 测定条件发生变化时 如更换标准品和试剂等 应重新绘制 2 标准品应有高的纯度 标准液的配制应准确 3 当待测液吸光度超过线性范围时 应将标本稀释后再测定 4 标本测定的条件应和标准曲线制作时的条件完全一致 用波长200 400nm的紫外光谱测定无色物质的方法称为紫外分光光度法 芳香族类及含有共轭双键的烯烃 炔烃等不饱和烃类 在200 400nm波长范围具备光吸收特性 故不需经显色反应就能直接利用紫外分光光度法测定 其选择性和灵敏度均高于比色分析法 五 紫外分光光度法 一 单组分测定原理其基本原理与可见分光光度法相同 除可采用前述的标准曲线法和对比法外 还可采用 1 吸光系数法对于单一组分的纯物质 只要已知其摩尔吸光系数 测得吸光度 A 后 可直接按下列公式计算物质的浓度 例 已知维生素B12的水溶液在361nm波长处的 为28056 2ml维生素B12的水溶液用蒸馏水稀释到4ml 用1cm比色杯测得溶液的吸光度为0 414 求该维生素B12水溶液的浓度 二 多组分混合物的测定原理多组分指同一试样中含两种或两种以上待测组分 测定时可根据各组分吸收光谱的重叠程度来确定定量方法 1 各组分吸收峰不相互重叠按单组分测定方法2 各组分吸收峰相互重叠可采用解联立方程法 等收吸双波长法 系数光谱法 一 火焰光度法是利用火焰使金属元素激发 能发射出特征谱线的特点进行测定的一种方法 1 基本原理某些金属元素的基态原子受到火焰激发后 其外层电子获得能量而从基点跃迁到激发态 接着它们又以发射光谱的形式释放出所获得的能量 而返回基态 在相同条件下 同一元素所释放的单位能量相同 故能形成固定光谱 六 其它光谱分析技术 如钠发射光谱波长589nm 钾发射光谱波长767nm 由于火焰供给的能量不强 只能激发碱金属和碱土金属元素 生化检验中常用于钾 钠的测定 元素的发射谱线强度与该元素浓度的关系可表示为I a c ba是与试样组成 激发温度 激发电位有关的常数 b为自吸收系数 当浓度很低时 b 1 所以上式可写成I a c 即发射谱线强度与测定元素浓度成正比 2 干扰因素 1 共存元素的干扰 共存元素产生的辐射干扰由于火焰使标本中其他元素激发 当发射时光谱接近 甚至重叠时 可产生干扰 引起误差 如钙对锂 钠的测定干扰明显 阳离子的干扰主要是通过对待测阳离子的电离度产生影响 造成发射时强度的改变 阴离子的干扰因阴离子可与某些被测阳离子在火焰温度下形成仅能缓慢蒸发的化合物而抑制了原子激发 一般用释放剂来消除干扰 与干扰阴离子牢固结合 2 火焰对测定的影响火焰是激发光源 火焰的纯度和燃烧状态 稳定性 可直接影响分析结果的准确度 因此 要求所用燃料燃烧时火焰背景色浅 温度高 无杂色 3 标准品的影响由于生物样品中成分复杂 定量测定中会互相干扰影响测定的准确性 所以 如果以单纯的被测物质预制标准液则与血清样品的结果相差甚远 故应使用血清作为标准以消除影响 二 原子吸收分光光度法1 基本原理待测元素经原子蒸气发生器转化成气态原子 处于基态 由空心阴极灯提供的待测元素的共振线经过待测元素的蒸气 共振辐射强度被蒸气中待测元素的基态原子吸收而减弱 其吸收规律遵循Beer定律 共振线 电子从基态跃迁至第一电子激发态的最低振动能级所吸收的谱线为共振吸收线 简称为共振线 2 应用在医学检验中主要用于体液 毛发 指甲等组织钙 镁 铁 钠 锌 铝 汞 铅 砷等多种元素的测定 优点 选择性好受干扰少 原子吸收是光的窄带吸收 仅0 001 0 01nm 而分子对光的吸收是宽带吸收 达几个nm 灵敏度高能测定10 9 10 6g的元素 测定快速 简便 应用范围广只需更换不同空心阴极灯 仪器昂贵 三 荧光分析法利用某些物质光致发光的特性 籍此对物质进行定性 定量分析的方法 1 基本原理某些物质的分子吸收了光能 从基态跃迁至某一电子激发态中的某一振动能级 处于激发态的振动能级中的分子通过运动或与其他分子的碰撞而将吸收过多的能量输给其他分子 并返回到第一激发态的最低振动能级 同时发射荧光 跃迁到基态发射荧光 在一定浓度范围内 其荧光强度与溶液浓度呈线性关系 2 影响荧光强度的因素 1 溶剂增大溶剂的极性 可时电子跃迁的能量降低 荧光增强 2 温度 pHT 分子碰撞频率 因此荧光强度随温度升高而减弱 pH可影响化合物电离或使荧光物质水解 如苯胺在pH7 12溶液中主要以分子形式存在 产生蓝色荧光 而在pH13的溶液中以离子形式存在 不能产生荧光 3 激发光和发射光在定量测定时 一般应选择荧光物质的最大激发波长 ex 和最大荧光波长 em 但有些荧光物质化学性质不稳定 受激发光照射后易分解 缩短样品照射时间 改变激发光波长 4 物质浓度的影响荧光分析品适合稀溶液 因荧光物质浓度高 分子间碰撞增加 使荧光强度减弱 这种现象称为自熄灭 自熄灭现象随浓度增加而增强 3 仪器与测定方法作为荧光分析的仪器有光电荧光计和荧光分光光度计光电荧光计的结构与光电比色计很相似 不同之处是检测器与光线成直角 并多一块滤光片 如滤光片改为棱镜或光珊作单色器 就和可见紫外发光光度计相似而成荧光分光光度计 仪器的组成部件的比 光源单色器测定池光敏元件检测器光电比色计钨灯滤光片玻璃光电池检流计 二面透光 光电管光电荧光计卤钨灯滤光片玻璃光电管检流计 300 700nm 两块 四面透光 检流计可见紫外钨灯光栅或棱镜分光光度计 400 760nm 玻璃光电管检流计氢灯石英光电倍增管自动记录 200 400nm 荧光分光氙弧灯光栅或棱镜玻璃光电倍增管自动记录光度计 200 700nm 石英 氙弧灯发射的强烈紫外线对人眼有害 荧光分析优点 灵敏度高比可见紫外吸收光谱高103 104倍 特异性强通过选择合适的激发光波长和荧光波长可避开其它物质干扰 操作简便 快速 重现性好 样品用量少 不足之处 应用范围有一定局限性 因许多物质不能产生荧光 对测定条件要求严格 如试剂 溶剂不应含有荧光物质 仪器价格较贵荧光分析法在医学检验中可用于测定类固醇激素 肾上腺皮质激素 及代谢产物 单胺类神经递质 儿茶酚胺 5 HT 某些维生素 VitA B族 电化学分析是一种以溶液电化学性质为基础测定物质含量的分析方法 按测定量的电化学参数的不同 可分为电位法 电导法 库仑法 极谱法和伏安法等 下面主要介绍电位法中的离子选择电极法 第二节电化学分析 是一种电化学敏感器 它的电势与溶液中给定离子的浓度的对数成线性关系 故可以通过简单的电位测量 直接测定溶液中离子活度 离子浓度与离子活度的关系a f c在稀溶液中 10 4mol L以下 活度系数接近1 离子选择电极 ionselectiveelectodeISE ISE分析法的优点 1 是一种直接的非破坏性分析方法 可反复进行 不受样品溶液颜色 浑浊等因素的干扰 2 分析速度快 单次分析通常只1 2min3 测量范围宽 4 5个数量级4 操作简便5 测量特定离子活度 对临床医学和基础医学更有实用意义 ISE大都属于膜电极 膜中含有与待测离子相同的离子 膜的内表面与具有相同离子的固定浓度溶液接触 其中插入一内参比电极 当膜的外表面与待测离子溶液接触时 引起膜电位的改变 由于电极膜材料 制备方法不同 使电板的稳定性 选择性和灵敏度也不同 一 ISE分析法的基本原理 一 ISE分析法的基本原理 膜电位的产生 将电极插入待测离子溶液中时 由于离子的交换和扩散作用 改变了两相中原有的电荷分布 因而存在一定的电位差 因为内充溶液中有关离子的浓度恒定 内参比电极的电位固定 所以ISE的电位 E 只随离子活度不同而改变 其电位可用Nernst方程式表示 ISE的E值不能直接测定 必须将ISE与参比电极浸入被测溶液中组成原电池 然后通过电动势来测定E值 参比电极 是指在温度 压力恒定的条件下 当被测溶液离子浓度有所改变时 电极电位保持不变的电极 二 离子选择电极的分类 一 晶体膜电极其敏感膜为金属微溶盐 经加压成片 制成单晶 多晶或混晶体电极敏感膜 如氟电极 其敏感膜为LaF3单晶片 二 非晶体膜电极1 刚性基质电极其敏感膜为玻璃 故称为玻璃电极 成分一般为Na2O AI2O3 SiO2改变这三种成分的配合比例 分别制出对Li Na K Ag 的离子选择电极 2 流动载体电极其敏感膜是由溶解在与水不相混溶的有机溶剂中的离子缔合剂或混合剂作为离子交换体 再将此溶液渗透在具有惰性 微孔性和疏水性的塑料薄膜内 三 气敏电极是基于界面化学反应对气体敏感的电极 它是在一般的离子选择电极的基础上 再覆盖一层疏水的透气膜 如聚四氟乙烯 如CO2 NH3电极 四 酶电极它由离子敏感膜和覆盖在表面含有酶的酶涂层胶组成 敏感膜对待测物的酶促反应有选择性响应 如尿素酶电极 1 响应范围及检测下限 响应范围是指电极对待测离子的响应符合Nernst式的线性区 此范围越宽越好 一般在4 7个数量级之间 检测F限是指能够检测被检离子的最低浓度一般在10 5 10 7mol L 2 选择性是指电极对待测离子和共存干扰离子的响应程度的差异 常用选择性系数或选择比系描述 选择性系数越小 表示电极选择性越强 三 离子选择电极的性能 3 响应斜率和转换系数ISE在Nevnet响应范围内被测离子活度变化10倍所引起的电报电位变化的数值 即响应斜率 S 从理论上说 但对某一ISE来说 实际S值与理论S值并不完全相符 其偏差用转换系数表示 一般转换系数达到理论值90 以上的电极性能较好 4 电极寿命取决于电极制作材料 结构和使用保管情况 1 标准曲线法配制一系列不同浓度标准溶液 测定其电位值Es 绘制Es lgc标准曲线 在相同条件下测定样品溶液电位值Ex 2 电极校正法用标准溶液校正ISE 制成直读式电仪表 四 IES的分析定量方法 1 电动势测量 对于一价离子的响应 电势测量每差1mV引起浓度的相对误差为4 对于二价离子则为8 因此对于测量电势的仪器精度要求达到0 1mV 2 温度Nernst公试中的斜率 内参比电极的电信号 以及离子活度等都与温度有关 因此在整个测量过程中应保持温度恒定 五 ISE分析方法的误差 3 pH溶液pH值可影响被测离子在溶液中的存在形式 从而影响相应离子的活度 如LaF3电极测定F 时 如pH 5 F 则会生成HF 使结果偏低 4 滞后效应使用ISE若先测浓溶液后 再测稀溶液时电位平衡缓慢并出现误差 这一现象称为 滞后效应 一 电泳的基本原理 一 电泳的概念溶液中带电颗粒在直流电场中向电荷相反方向移动的现象称为电泳 利用电泳现象对物质进行分离的技术叫电泳技术 第三节电泳技术 电泳技术的应用始于1937年 瑞典Tiselius利用界面电泳将血清蛋白质分离成五种成分 1948年Wieland发明纸电泳 使电泳技术大为简化 此后 电泳技术发展迅速 特别是电泳技术与层析法 免疫学方法的结合 使其分辨率达到mg ml水平 成为医学检验的一种重要分析技术 二 溶液中粒子的带电状态蛋白质分子电离时有带正电荷的氨基 也有电离带负电荷的羧基 故蛋白质是一种两性电解质 在酸性条件下 羧基电离受抑制 NH2 NH3 带正电在碱性条件下 羧基电离增强 COOH COO 带负电 三 电泳迁移率指带电粒子在单位电场强度作用下的电泳速度 通常用 表示 V EV为粒子移动速度 cm s E为电场强度 V cm 迁移率取决于带电粒子的性质 粒子所带电量Q 粒子大小r形状 介质粘度 对于球状分子 根据Stoke定律V QE 6 r U Q 6 r 在实际测定中 电泳速度V以单位时间t 秒 内移动的距离d 厘米 表示V d t cm s 电场强度E以单位长度I 厘米 上所施加的电势差V 伏特 表示E V I V cm 故u V E d t V I d I V t cm2 v s 通过测量d l v t便可计算出颗粒的迁移率 由于不同的带电粒子其迁移率的不同 因此在同一电场中的移动距离不同 故能将其分离 根据公式dA V t l AdB V t l BA B移动距离差为 d dA dB dA dB V t l分离距离与电压和电泳时间成正比 与支持物长度成正比 二 电泳的分类和电泳仪 一 电泳的分类1 根据被分离样品的多少分析电泳 制备电泳 2 根据电泳电压的高低常压电泳 高压电泳 3 根据是否使用支持介质自由电泳 区带电泳 4 根据电泳系统的组成是否均一连续电泳 不连续电泳 二 电泳仪由直流电源和电泳槽两部分组成 1 直流电源将交流电源经整流 滤波后获得 分为 1 恒压电源电泳过程中的电压恒定不变 但电泳过程中的热效应 降低外周电路的电阻 使电流慢慢增大 2 恒流电泳电泳过程中的电流恒定不变 用这种电流的输出电压可随外周阻力减少而减少 从而保持电流恒定 3 恒功率电源电泳中输出功率恒定不变 主要用于等电聚焦电泳 2 电泳槽盛装缓冲液和进行电泳分析的场所 一般用塑料和有机玻璃制成 它包括电极 缓冲液槽 电泳支架 透明盖组成 电泳槽的外形有水平式 垂直式 圆盘式等多种 电极应具有良好的导电性 抗腐蚀性和抗电解作用 以铂金材料最为理想 最好贯穿整个缓冲液槽 三 影响电泳的因素 一 缓冲液维持电泳介质pH恒定 并起导电作用 1 组成由弱酸和弱酸盐组成 常用的有磷酸盐 硼酸盐 巴比妥盐和三羟甲基氨基甲烷 Tris 等 其中巴比妥缓冲液用的最多 由巴比妥钠和巴比妥组成 选择缓冲液时应考虑的因素 1 化学性能稳定 不易水解 2 缓冲液的pH应与弱酸的pK值接近 有较强缓冲能力 3 缓冲液中正负离子应有相近的迁移率 避免电晕出现正负离子分布不均 4 缓冲液的离子应该是一价的 多价离子有较厚的双电层 移动性差 5 缓冲液的电导率要低 避免通电时产生较多的热 2 pH缓冲液pH决定了蛋白质的带电状态 电泳时应选择一个合适pH 使各种蛋白质在这一pH时净电荷差别最大以利于分离 血清蛋白醋酸纤维薄膜电晕常用pH8 6的巴比妥缓冲液 各种蛋白质均带负电荷 电泳时向正极移动 缓冲液pH的计算pH pKa lg 盐 酸 电泳过程水会发生电离 正极 2OH H2O 1 2O2 2epH 负极 2H 2e H2 pH 故电泳2 4次后应将缓冲液正极交换 减少这种影响 3 离子强度是指溶液中各种离子的摩尔浓度 Ci 与其电荷数平方 Zi2 乘积总和的1 2 即I 1 2 CiZi2I的单位是mol L 如0 1mol LNaCLI 0 1mol L0 2mol LMgCL2I 0 6mol L对于缓冲液I计算 由于弱酸的电离度很低 一般只计算盐的 I愈大 缓冲能力越大 pH越稳定 但缓冲液所载分电流增加 样品所栽的电流减少 电泳速度减慢 导电能力增加 产热增加 I过小 缓冲能力小 pH不稳定 缓冲液所载分电流减少 样品所载分电流增加 缓冲液粘度系数降低 电泳速度加快 但样品在支持物上扩散严重 分辨率降低 兼顾两方面的影响 一般在0 05 0 1mol L 二 支持介质对支持介质的基本要求是具有化学惰性 不与被分离的样品或缓冲液起化学反应 并具有一定的坚韧度 1 吸附使被分离样品滞留 而降低电泳速度 造成拖尾而使分辨率降低 2 电渗电泳过程中液体对固体支持物的相对移动称为电渗 实际上是电泳材料表面的电荷引起水的定向移动 当电渗作用方向与电泳方向一致 电泳速度加快 顺水行舟 当电渗作用方向与电泳方向相反 电泳速度减慢 逆水行舟 四 常用电泳技术区带电泳是目前应用最广泛的一种电泳技术 区带电泳的支持介质常用的有滤纸 醋酸纤维薄膜 凝胶等 一 滤纸电泳 PE 是应用最早的支持介质 优点 材料价廉易得 有一定机械强度 缺点 电泳时间长 8 10h 吸附作用大 造成拖尾而降低了分辨率 目前已淘汰 二 醋酸纤维薄膜电泳 CAE 1957年Kohn首先采用 醋酸纤维素是将纤维素分子中葡萄糖单体上的羟基乙酰化而形成纤维素醋酸酯 然后用丙酮和水的混合溶剂溶解 涂成均匀薄膜 优点 对蛋白质吸附作用很小 分辨率高 区带清晰 不吸附燃料 区带周围燃料可完全清掉 检测灵敏度较高 样品用量少0 3 2 l 电泳时间短20min 1小时 可透明 便于用光密度扫描仪定量 缺点 有轻度电渗作用 吸水性较差 较脆 三 琼脂糖凝胶电泳 AGE 琼脂糖是从琼脂中分离得到的一种多糖 主要由半乳糖和L 3 6 脱水半乳糖构成 常用浓度0 5 1 0 优点 吸附作用 电渗作用很小 故分辨率重现性好 应用广 同工酶 脂蛋白 免疫电泳 样品用量少0 6 3 0 l 电泳时间短30min 1h 透明度好 电泳后可直接扫描定量 也可烘干制成薄膜 缺点 电泳完毕后区带易扩散 可及时固定 点样方法 挖孔法 滤纸插入法 四 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 是一种人工合成的高分子材料 60年代新用于电泳分析 能将血清蛋白分为20多种组成 优点 1 具有分子筛作用 分离效果好 2 化学稳定性高 是一种稳定的亲水胶体 3 几乎没有吸附和电渗作用 4 机械强度好 无色透明 可直接光密度扫描 5 可调节凝胶孔径以适合不同分子量的分离 1 聚合丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺聚丙烯酰胺 Acr 单体 Bis 交联剂化学摧化过硫酸铵 TEMED 四甲基乙二胺 系统加速剂TEMED促使引发剂过硫酸铵形成自由基 自由基与Acr接能 使Acr单体形成自由基而活化 从而引发聚合 聚合速度与pH 单体浓度 温度有关 引发剂加速剂 光催化核黄素 TEMED系统 核黄素经光照被还原成无色核黄素 在和痕量氧的条件下 无色核黄素又被氧化成核黄素自由基 使Acr活化 从而引发聚合 优点 核黄素用量少 10mg L 对样品分析无影响 聚合时间可通过调节光照时间 强度来控制 2 孔径与机械强度凝胶孔径由凝胶总浓度和交联度决定 凝胶总浓度T g dl 表示100ml凝胶中Acr和Bis的总克数 T值越大 孔径越小 交联度C 表示交联剂Bis占凝胶总浓度T的百分比 C值越大 孔径越小 T值固定不变时 C值在5 时 凝胶孔径最小 大于或小于5 孔径都会增大 常用标准胶T 7 5g dl 孔径约5nm 凝胶的机械强度 弹性 透明度全要取决于T及Acr与Bis的比值 通常要求 T为2 5 Acr Bis 205 10 Acr Bis 4015 20 Acr Bis 125 200 3 分类圆柱型根据凝胶的形状水平式平板型垂直式根据凝胶系统和缓冲液组成 连续 均相 操作方便 不连续 多相 分离效果好 4 分离原理聚丙烯酰胺凝胶电泳大多属于不连续电泳 1 两种不同孔径的凝胶系统 2 电泳过程中形成不均匀不连续系统上层大孔径浓缩胶T2 3g dl Tris HCl pH6 7 下层小孔径分离胶 T5 10g dl Tris HCl pH8 9 电极缓冲液Tris 甘氨酸pH8 3 3 电极槽两层凝胶中的缓冲液pH和组成不同 高分辨率主要是由于下面三种效应1 样品浓缩效应Cl 迁移率最大 快离子 解离度最小的甘氨酸离子迁移率最小 慢离子 蛋白质离子介于两者之间 快离子与慢离子之间形成低导电区 有较高的电位梯度 促进蛋白质和慢离子的移动 使蛋白质样品被压缩为一薄层 2 分子筛效应蛋白质进入分离胶 由于凝胶有一定的孔径 不同的蛋白质分子大小不同 受到的阻力不同 小分子受阻力小 走在前面 大分子受阻力大 走在后面 3 电荷效应同一般电荷 五 蛋白质区带的定性和定量分析 一 蛋白质区带的染色蛋白质电泳分离后可以直接用紫外光密度扫描仪定量 利用蛋白质对280nm紫外光的吸收 但需专门的仪器 故临床上一般采用染色来进行定性或定量分析 蛋白质染色剂大多是阴离子燃料 易与蛋白质阳离子结合 因此在pH pI的酸性溶液中较强 常用的染色剂有氨基黑10B 溴酚蓝 丽春红S 二 蛋白质区带的定性分析经染色后 首先应仔细观察有无异常区带 如多发性骨髓瘤病人有大量单克隆蛋白质 主要是IgG或IgA 电泳时可在 和 之间呈现一条区带 称为M区带 三 蛋白质区带的定量分析蛋白质电泳的定量分析通常以各区带占总量的百分率表示如同时测定了蛋白质总量 也可换算成各组分的绝对量 g L 表示 总蛋白75g LA 66 1 3 2 7 10 15 49 5g L2 25g L5 25g L7 25g L11 25g L 1 光密度仪直接扫描法透明的电泳图谱可用光密度仪直接扫描得出各组分的百分率 操作简便 迅速 误差小 结果较准确 2 洗脱比色法染色后将各区带分别剪下侵入适当的溶剂中 将蛋白质吸附的染料全部洗脱然后进行比色 求出各组分的百分含量 操作繁琐 费时 准确度不如光密度仪直接扫描法 六 特殊电泳技术 一 等电聚焦电泳 IFE 是利用具有线性pH梯度的两性电解质为载体 分离等电点不同的蛋白质等两性分子的一种电泳新技术 其分辨率可达0 01pH单位 特别适用于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质分子 正常人血清蛋白质采用此法可分出50多条区带 1 基本原理在电泳系统中建立一个从正极到负极 pH由低到高的连续而稳定的pH梯度 处于这一系统的各种蛋白质 根据各自pI与所处环境pH值的差别带上正电或负电 电泳时逐渐靠近与其pI相同的pH位点 而不断失去净电荷 直至达到pH pI 净电荷为零时 不再受电场力的作用 而达到聚焦 2 基本条件 建立一个稳定 重复性良好的连续pH梯度 有一个抗对流的材料 防止已分离样品重新混合 电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带 3 pH梯度的建立能建立稳定pH梯度的两性电解质是一种多羧基 多氨基的脂肪族化合物 如瑞典LKB公司生产的商品名为 Ampholine 的 它由丙烯酸和多乙烯多胺合成 理想的两性电解质载体应具备以下特点 1 各成分的导电能力彼此相近 2 各成分的pI彼此接近 并在pI附近有良好的缓冲能力 3 分子量小 易于与样品分离 4 对280nm紫外光没有或仅有很低的吸光度 不干扰样品测定 二 双向电泳是先把样品从一个方向进行电泳分离 然后在与其成90 方向上进行第二次电泳分离 如第一次电泳可以其电荷性质为基础 第二次电泳则以分离量不同进行分离 通常将等电聚焦电泳为第一相电泳 以SDS 聚丙烯酰胺凝胶为第二相电泳 三 转移电泳又称印迹转移电泳 此项技术是1975年由Southern在进行DNA片段的研究中首先使用 将凝胶电泳所得区带经吸附作用转移到硝酸纤维薄膜 NC膜 上 由于转移过程类似于将墨迹吸到吸水纸上 故称为 Southernbolt印迹法 1977年Alwine将此法应用于RNA研究 取名Nerthernblot 1979年Towbin又将其扩展到蛋白质研究 将其风趣的称为Westernblot 1981年 Reinhart等将等电聚焦电泳后的蛋白质转移到NC上 取名为Easternblot 转移电泳技术包括三个步骤1 采用凝胶电泳分离蛋白质或核酸 电泳方式有单向 双相 梯度 等电聚焦等 2 转移电泳 将已分离的蛋白质或核酸经电泳转移到NC或重氮苄氨基甲基纸上 前者为非共价吸附 后者为共价结合 3 鉴定膜上的蛋白质或核酸 方法有 放射自显影 酶标免疫化学等 转移电泳的优点 对分离蛋白质的鉴定 比在凝胶上的操作要简便 转移电泳实际上是将凝胶电泳的高分辨率与放射标记或酶标等免疫化学法的高灵敏度结合起来 第四节层析技术层析法又称色谱法 色层分离法 1906年由俄国植物学Jauett首先用于植物色素的分离提取而得名 目前 层析技术发展迅速已成为生物化学 分子生物等及生物工程等学科常用的分离分析方法 如气体 无机离子 AA 糖类 脂类 Vit 药物 以及大分子物质 蛋白质 核酸等物质的分析 一 层析的概念与分类 一 基本概念层析法是利用待分离物质中不同组分的某些理化性质 在两相中溶解 吸附 紊和作用等 的差异而建立起来的一种分离技术 所有的层析系统均由因定相和流动相组成 固定相是固体物质或固定于固体物质的液体 流动相是可以流动的物质 如水 某些溶剂和气体 当待分离的混合物随流动相通过固定相时 由于混合物中各组分的理化性质的差异 它们在固定相和流动相中的分配比不同 随溶媒的向前移动 各组分不断地在两相中进行再分配 与固定相作用力越弱的组分 随流动相移动时受到的阻滞作用小 向前移动速度快 反之 与固定相作用强的组分 则向前移动速度慢 如纸层析 薄层层析 薄膜层析 层析移动的速度用比移值或阻滞因子 Rf 来表示 二 层析法分类1 按两相所处的状态不同分类按流动相的状态不同 再按固定相的状态不同 气相层析 液相层析 气固层析 气液层析 液固层析 液液层析 层析法 2 按层析分离机制 分离原理 分类 1 吸附层析法 AC 固定相是固体吸附剂 利用各组化吸附剂表面吸附能力的差别而分离 2 分配层析法 PC 固定相是液体利用各组分化流动相和预止液相同 固定相 中的分配系数不同的分离 3 离子交换层析法 IEC 固定相是离子交换剂 利用各组分对离子交换剂亲和力的不同而分离 4 凝胶层析法 GPC 固定相为多孔性凝胶 利用各组分分子大 形状不同在凝胶中受阻滞的程度不同而分离 5 亲和层析法利用各组分生物学特殊性不同而建立的一种层析方法 固定相工能和一种待分离成分类一结合 使其与其他物质分离 如利用抗原 抗体的结合来分离相应的抗原或抗体 3 按操作形式不同分类 1 柱层析法 CC 固定相装于柱内 使样品沿一个方向移动向到分离 2 薄层层析法 TLC 将颗粒状的固定均匀地铺在薄板上 点样后用流动相展开 3 纸层析法 PC 用滤纸作为液体的载体 点样后用流动相展开 4 薄膜层析法 TFC 用高分子有机吸附剂制成薄膜 以类似纸层析的方法进行物质的分离 二 层技术在生化检验中的应用 一 薄层层析在生化检验中的应用薄层层析根据固定相的不同有吸附 分化和离子交换等技术 以吸附薄层层析为例说明其基本方法 1 固定相与流动相及选择 1 固定相为吸附剂 常用的有硅胶 氯化铝 硅薄土纤维素等 固定相选择时应考虑的因素 吸附剂如硅胶是弱酸性吸附剂 适合于酸性和中性物质的分离 氢化铝是微碱性吸附剂 适合于碱性和中性物质分离 硅薄土 纤维素 属性吸附剂 吸附能力常称为活度 主要受吸附剂含水量的影响 含水量高活度低 从强到弱分为I 5级 活度强吸附作用强 一般分离水溶性物质活度弱些 而分离脂溶性物质活度要强些 颗粒状大小为了使每次测定的Rf值恒定 吸附剂要求颗粒大小均匀 适当 颗粒细 吸附能力强 展开慢 颗粒粗 吸附能力弱 展开快 分离放开差 一般颗粒直径为无机类0 07 0 1mm 70 140目 2 流动相即展开剂 展开剂的选择是薄层层折中又一关键 一般极性大的化合物需用极性大的展开剂 2 薄层层折法操作技术 1 制板常用方法有三种 干法 湿法和烧结法 干法制板 软板 常用厚度0 25 3 0mm 方法简便 但不坚固易吹散 只能水中放置 点样 显色需加小心 湿法制板 硬板 加入一定粘合剂 石膏 羧甲基纤维素钠 淀粉等 烧结法制板吸附剂 加入一定量无水乙醇调成糊状制板 然后放入高温炉中加热至750 60 75mm 机械强度好 可反复使用 制成的板要求涂布均匀 晾干 活化 2 点样用毛细玻管点样 斑点直径均2mm 板据需要可点2 3次 点样处距下端1 5cm 3 展开将层折板放入加有展开剂点层折槽中 立即盖严 展开距离10cm取出 划出溶剂前沿线 4 显色等溶剂挥发后 用相应显色剂显色 3 薄层层折法的定性及定量定性分析主要依据Rf值 与标准液的Rf比较 定量 采用专用的薄层扫描仪 测量斑点的薄线大小 并与标准液斑点比较 4 应用主要用于AA 肽 核苷酸 糖类 脂类和激素等物质的分离和鉴定 二 凝胶层折在生化检验中的应用又称凝胶过滤 分子筛层折 排阻层折 固定相是多孔凝胶 商品凝胶是干燥颗粒 当吸收一定量液体后溶胀成一种柔软而富有弹性 不带电荷 不与溶质互作用的惰性物质 由于凝胶有一定孔径 对分子大小不同的组分的阻滞作用不同 在被分离物质中 大分子组分由于直径大 不当进入凝胶孔径内 随流动相向前移快 小分子组分则能进入凝胶微孔内 向前移动慢 而达到分离 1 凝胶的种类和性能常用的凝胶有葡聚糖 凝胶 聚丙烯酰凝胶和琼脂糖凝胶 1 葡聚糖凝胶将右旋葡萄糖的线性聚合长链间 用交联剂1 氯代 2 3 环氯丙烷通过醚桥交联而成 稳定性好 不溶于水 但在酸性条件下糖易水解 由于分子中会有大量羟基 因此有很大的吸水性 吸水后溶胀成透明 而且有三维空间网状结构的弹性颗粒 孔径的大小与交联度有关 交联度大 孔径小 吸水量小 商品胶型号多以吸水量10倍表示 如每克干胶吸水量为2 5g 即为G 25型 最常用的交联葡聚糖商品名为Sephadex 2 聚丙烯酰胺凝胶层析用的聚丙烯酰胺凝胶商品名为生物凝胶 P Bio gel P 是由丙烯酰胺 Acr 和甲叉双丙烯酰胺 Bis 经自由基引发聚合而成 型号有P 2 P 4 P 6 P 10 P 30 P 60 P 100 P 150 P 200 P 300 可分离子肽及蛋白质量 100 40万 具有隋性 但在酸碱性较强的情况下如葡聚糖凝胶稳定 适用pH范围2 11 使用范围与型号和葡聚糖凝胶相似 3 琼脂糖凝胶属于天然凝胶 从琼脂中提取结构为D 半孔糖和L 3 6 脱水半孔糖的线基交替所组成的多聚糖 常用商品名是Sepharose和Bio gel A 型号有Sepharose2B 4B 6B 数字表示琼脂糖含量 W W 机械强度大 分子量使用范围宽 达108 吸附生物高 分子勇最低常用生物高分子物质的分离 但稳定性很差 使用条件限制很严格 T0 40 pH9 2 凝胶层折中注意的几个问题 1 柱直径与长度凝胶层折一般为柱层柱 柱直径一般在1 5cm 长度L与直径D比值L D一般为7 10 但对移动缓慢的物质宜30 40 2 凝胶的选择一般要以大分子物除去小分子物质时 如从蛋白质溶液中除盐和AA可选用交联度大的 如葡聚糖G 25或G 50 反之欲将小分子物质收集浓缩而去除大分子 则应选用交联度小的 如G 100或G 150 3 静水压Vo和Vi的比值 分离时需维持一定的静水压 孔径愈大 最高静水压愈低 如G 10 最高静水压 100cm 而G 100 35cm Vi指凝胶孔隙中水的体积称为内水 Vo指凝胶颗粒之间水的体积 称为外水 装柱良好的凝胶柱 其Vo Vi的比值应为40 60 4 样品的浓度和体积大分子物质溶液粘度随浓度增大而增大 而影响分离效果 一般将粘度控制在5cp 厘泊 以下 样品体积小于凝胶总体积的5 10 3 凝胶层折的应用 1 去盐高分子 如蛋白质核胶 多糖等 溶液的低分子杂质 可用凝胶层折法除去 这一过程称为去盐 2 高分子溶液的浓缩如蛋白质的稀溶液需要浓缩时 可加入葡聚糖G 25或G 50的干胶 蛋白质稀溶液中的水份及小分子物质进入凝胶颗粒内部孔隙中 蛋白质则在颗粒外 将溶胀后的凝胶分离除去 得到浓缩的蛋白质浓液 3 用于分离提纯广泛用于酶蛋白质 AA 核苷酸多糖 激至少 抗生素 生物碱等物质的分离提纯 4 用于测定高分子物质的分子量用一系列已知分子量的标准样品 放入同一凝胶柱 在同一条件下层折 测定每种组分的保留体积 并以保留体积对分子量的对数作用 得到分子量标准曲线 三 高效液相层折化生化检验中的应用高效液相层折 highpeilozmamceliguidchomatagaphyHPLC 又称为高效液相色谱法 始于60年代末 是在经典液相层折法基础上引进气相层折理论发展起来的 它具有气相层折的全部优点 同时克服了气相层折的缺点 具有分离能力强 测定灵敏度高 ng水平 应用范围广 极性到非极性 小分子到大分子 热稳定与不稳定化合物 在室温下进行等优点 HPLC装置仪器化它包括输液系统 层折柱和检测系统三部分 输液系统主要是高压泵将流动相输入 层折柱按分离机理不同分为 吸附 分配 离子交换等类型 检测器应用最多的是紫外吸收检测器 荧光检测器 信号送入数据处