精品重组人神经型一氧化氮合酶课件_1

重组人神经型一氧化氮合酶催化阿霉素单电子还原的研究 导师 赵迎社副教授井柳尧教授 日本 研究生 付捷专业 生物化学与分子生物学 硕士学位毕业论文答辩 研究背景 1 人类神经型一氧化氮合酶的结构和功能特征 2 醌类药物阿霉素的心肌毒性与一氧化氮合酶催化的单电子还原有关 哺乳动物体内的一氧化氮 NO 和一氧化氮合酶 NOS L 精氨酸 O2 一氧化氮合酶 NOS NADPH 瓜氨酸 NO 神经冲动传导 血压调节 免疫应答 同工酶 神经型NOS nNOS 内皮型NOS eNOS 诱导型NOS iNOS 表达方式 主要调节方式 组成型表达 组成型表达 诱导型表达 钙离子浓度 磷酸化 诱导因子 分子量 160kD 130kD 135kD 人神经型一氧化氮合酶 hnNOS 的结构 FMN FAD NADPH N C 精氨酸结合位点 蝶呤结合位点 Heme结合位点 CaM结合位点 还原酶结构域 氧化酶结构域 Cit NO Arg O2 Heme FMN FAD NADPH 2e e e hnNOS中的电子传递 FAD FMN FAD FMNH FADH FMNH FAD FMNH2 FADH FMNH2 FADH2 FMNH FADH2 FMNH2 完全氧化态 单电子还原态 双电子还原态 三电子还原态 完全还原态 1 FMNH2是电子传递过程中的主要活性形式 2 空气稳定半醌 FAD FMNH 是该黄素对在体外有氧条件下的稳定存在形式 3 钙离子 钙调蛋白结合能促进分子内电子传递 醌类药物的致病机制 氧化损伤 O O HO HO O OH OH O O NH2 OH Me MeO adriamycin NADPH HO O HO HO O OH OH O O NH2 OH Me MeO adriamycin H O2 阿霉素醌类药物 阿霉素半醌 O2 e 一氧化氮合酶 研究目的 1 构建重组人神经型一氧化氮合酶的表达系 2 阐明人类神经型一氧化氮合酶催化阿霉素单电子还原的机制 技术路线及实验方法 构建hnNOS在大肠杆菌中的表达系 表达和纯化一氧化氮合酶 酶的表达和性质鉴定 分子克隆 原核表达系 阴离子交换层析和亲和层析 SDS PAGE WesternBlot 毛细管区带电泳 光谱法 表观代谢常数的测量 单电子受体特征波长吸光度的改变速度 钙离子浓度的作用 不同浓度钙离子条件下NADPH在340nm处吸光度的改变速度 阿霉素与氧自由基的生成 氧化型血红蛋白在576nm吸光度的改变速度 hnNOSs在阿霉素还原反应中的作用 630nm附近吸光度改变 反映黄素半醌的形成 技术路线 实验方法 实验结果 重组人神经型一氧化氮合酶的表达系构建 表达 纯化与性质鉴定 第一部分 构建hnNOS的原核表达系 pBluscriptSKI hnNOScDNA PCR NdeI XbaI pCWori NdeI XbaI 连接 转染E coli 蛋白表达鉴定 阳性克隆 Ampr NdeI XbaI酶切 重组质粒鉴定 分子克隆产物鉴定 1 12M 5 8kb 3 5kb 1 2 酶切产物 M 分子量Marker 2 重组质粒酶切 SmaI 鉴定 4 3kb 6 2kb 3 5kb 12M 1 2 PCR产物 M 分子量Marker 1 PCR产物鉴定 1 琼脂糖凝胶电泳 1 琼脂糖凝胶电泳 6 2kb 3 5kb 分子克隆产物鉴定 2 C 3 DNA测序结果 发现C 3668 T 其编码的脯氨酸 Pro 没有改变 1 2 3 1 细胞 2 离心后上清 3 离心后沉淀 4 蛋白质WesternBlot鉴定 使用兔抗鼠神经型一氧化氮合酶FMN结合结构域 纯化hnNOS 2 YT Amp50mg ml 30 IPTG d ALA 集菌 超声碎菌 离心分离 DE52阴离子交换层析纯化 2 5 ADPSepharose4B亲和层析纯化 蛋白洗脱 浓缩 缓冲液A 50mMHepes pH7 0 10mMEDTA 5 Glycerol 0 2mMPMSF M hnNOS 158kD 175kD 83kD 8 SDS PAGE FAD FMN 1 0 96 NO生成 CaM 0min 1 CaM 21 4 1 2min 1 hnNOS全长的光学特性 1 2 0 1 0 0 300 400 600 800 波长 nm 吸光度 400nm 450nm 475nm 650nm Hemeabsorption Flavinabsorption 0 2 0 1 0 300 400 600 800 波长 nm a OxideformofhnNOS b 5foldNADPH c 20minlater 596nm 475nm a b c 550nm hnNOS全长的光学特性 2 350 500 0 01 0 0 01 420nm 380nm 300 400 600 800 0 0 2 0 4 吸光度 400nm 395nm hnNOS L Argperturbation 波长 nm 精氨酸结合Ks 2 7mM 精氨酸结合差值吸收谱 吸光度 波长 nm hnNOS还原电子受体反应的表观动力学常数 电子受体 Km mM CaM CaM 铁氰化钾 细胞色素c NADPH 1227 95 898 72 7 1 1 3 5 0 1 0 0 88 0 12 0 44 0 14 NADPHwasusedasanelectrondonor NADPH FAD FMN Heme 铁氰化钾 细胞色素c CaM 2e 1e 1e 1e 1e kcat min 1 CaM CaM 4108 170 13900 588 144 19 2831 359 Activationfold 3 4 20 小结 1 用于细胞色素P450还原酶的原核表达系同样适用于人神经型一氧化氮合酶全长酶 2 重组人神经型一氧化氮合酶与鼠神经型一氧化氮合酶的性质相似 第二部分 重组人神经型一氧化氮合酶催化阿霉素单电子还原的研究 纯化hnNOSFAD NADPH FAD FMN结合结构域 辅酶钙调蛋白 CaM 2 3 M 1 1 FAD FMN结合结构域 2 FAD NADPH结合结构域 3 辅酶CaM 80kD 49kD 17kD 12 SDS PAGE hnNOSs还原醌类药物反应的表观动力学常数 电子受体 kcat min 1 Km mM CaM CaM CaM CaM 阿霉素 甲萘醌 丝裂霉素c FAD NADPH结合结构域 FAD FMN结合结构域 全长酶 50 4 12 2 78 6 21 3 43 10 41 9 10 1 10 1 14 2 11 1 28 5 15 3 55 9 7 3 0 3 13 1 294 14 288 14 5620 226 318 19 5729 615 478 57 565 16 5220 176 393 24 5662 229 38 3 121 8 1477 146 37 0 4 851 25 Ca2 CaM结合可促进hnNOSFAD FMN结合结构域 和全长酶对醌类药物的还原作用约20倍 阿霉素 甲萘醌 丝裂霉素c 1 hnNOS的氧化酶结构域对催化醌类药物的单电子还原作用没有明显影响 2 在Ca2 CaM存在的条件下 FMN是FAD FMN结合结构域和全长酶还原醌类药物的主要电子供体 NADPH FAD FMN Heme CaM 2e 1e 1e 1e 1e 醌类药物 Ca2 CaM的结合作用 A 全长酶 B FAD FMN结合结构域 CaM CaM 1 酶还原反应的加速作用与钙离子浓度呈正相关 2 酶与钙离子 钙调蛋白结合步骤不是反应的限速步骤 340nm 阿霉素与过氧化物 MD 210mV O2 MD O2 155mV Adr 292mV O2 Adr O2 155mV 2O2 2H H2O2 O2 SOD NADPH hnNOS 甲萘醌MD 阿霉素Adr MD Adr Hb Hb O2 O2 H2O2 O2 O2 Hb O2 动态平衡反应 MD Adr 1 2 3 SOD SOD对hnNOSs氧化血红蛋白生成的作用 0 50 100 150 0 5 10 15 20 25 hnNOS全长酶 25 20 15 10 5 0 hnNOSFAD FMN结合结构域 0 50 100 150 氧化型血红蛋白生成速度 mM min 超氧化物岐化酶 nM Ca2 CaM 甲萘醌 Ca2 CaM 甲萘醌 Ca2 CaM 阿霉素 1 O2 是反应的活性中间产物 2 阿霉素半醌较甲萘醌半醌易生成氧自由基 hnNOSFAD结合结构域对阿霉素的还原作用 0 10 20 30 40 50 DA 0 01 C 630nm DA 0 02 0 0 05 0 1 0 15 0 2 630nm B 时间 sec 吸光度 560 750 620 680 0 08 0 06 0 04 0 02 0 a d a 16ms b 40ms c 88ms d 184ms A 光谱测定 FAD结合结构域 NADPH 阿霉素 混合 波长 nm FADH2的还原活性高于FADH hnNOSFAD FMN结合结构域对阿霉素的还原作用 DA 0 02 CaM 630nm DA 0 02 0 50 100 150 200 CaM 630nm 时间 msec 560 750 620 680 a d a 16ms b 40ms c 88ms d 184ms CaM CaM a 40ms b 70ms c 130ms d 190ms a d 0 0 02 0 04 0 06 0 08 吸光度 0 0 02 0 04 0 06 0 08 波长 nm 1 hnNOS上结合的FMN半醌难与阿霉素反应 2 空气稳定半醌 FAD FMNH 是hnNOS还原阿霉素反应过程中的主要中间产物 小结 1 重组人神经型一氧化氮合合酶可以催化阿霉素的单电子还原反应 2 在钙离子 钙调蛋白存在的条件下 单电子受体阿霉素主要从FMN处接受电子 3 双电子还原半醌 FADH2 FMN或FAD FMNH2 和三电子还原半醌 FADH2 FMNH 或FADH FMNH2 是反应中的活性形式 均可以迅速传递一个电子给受体 4 钙离子 钙调蛋白通过加速分子间电子传递 促进酶对阿霉素的还原作用 结论 1 在大肠杆菌中成功构建重组人类神经型一氧化氮合酶的表达系 及纯化方法 2 如同细胞色素P450还原酶 人类神经型一氧化氮合酶在醌类药物生物转化过程中也起着重要作用 3 根据实验结果 我们提出了FAD FMN在反应中的电子传递模式图 FAD FMN对中的电子传递模式图 FADH2 FMNH FADH FMNH2 FADH FMNH FAD FMNH2 FAD FMNH e e NADPH CaM CaM e 已发表文章 1 JieFu KeitaYamamoto Zhi WenGuan ShigenobuKimura andTakashiIyanagi Humanneuronalnitricoxidesynthasecancatalyzeone electronreductionofadriamycin Roleofflavindomain ArchivesofBiochemistryandBiophysics inp