胃癌胰岛素样生长因子2基因的印迹状态的检测0522 ppt课件

胃癌胰岛素样生长因子 2基因的印迹状态的检测 大连医科大学生物学教研室 一 基因印记的概念是一种在基因组DNA水平对双亲等位基因特异性的修饰作用 结果导致来自不同性别亲本 父母 的同源染色体上等位基因存在功能上的差异 驴马正反杂交实验结果公驴 母马公马 母驴骡駃騠 基因组印迹现象最早由HelenCrouse于1960年在昆虫研究中首次提出 Sciara昆虫的两条X染色体 1980年 Cattanach等人发现 具有两条母源11号染色体的小鼠在胚胎期比正常小鼠小 而具有两条父源11号染色体的小鼠在胚胎期比正常小鼠大 但是 这两种小鼠胚胎都无法正常发育而死于发育阶段 1984年 McCrath等人用人工单性生殖的方法产生了两种特殊类型的小鼠胚胎 一种小鼠胚胎的全套染色体全部来自雄性亲本 另一种小鼠胚胎的全套染色体全部来自雌性亲本 但两类小鼠均在发育期死亡 1991年 Dechiara等人做了小鼠IGF 2剔除基因的实验 首次证明了生物体本身带有基因组印迹基因 实验发现 敲除父源IGF 2等位基因小鼠发育成成体个体小 但若剔除的等位基因来自母源 动物的个体没有变化 直至1993年 Feinberg实验室首次发现了基因组印迹也存在于人类 二 基因组印迹与肿瘤的关系IGF 2作为印迹基因 在正常人群里 只有父系的等位基因表达 母系的等位基因则处于静止状态 约有40 WT的患者肿瘤组织中发现有IGF 2等位基因父母系共同表达 这种静止的基因被重新活化表达的现象 称作LOI Lossofimprinting 结肠癌患者也可检测到IGF 2的LOI现象 而且这种现象不仅存在于癌组织 也存在于癌旁组织和病人的血细胞中 由此被认为这种现象很可能成为该病早期诊断的指标 此外 已经发现与基因组印迹异常有关的肿瘤还有肝癌 卵巢癌 胃癌 肺癌 神经胶质瘤 前列腺癌等等 目前已经被证实与人类肿瘤发生相关的印迹基因除IGF 2外 还有WT1 P57KIP2 P73 NOEY2以及M6P IGF 2R等等 三 IGF 2基因LOI的检测方法 1 DNA水平筛选杂合子2 RNA水平观察杂合性是否完整 酶切位点 GGGCC CGTGCCCC CCGGGCACGGG 即该序列在人群中存在SNP 等位基因a5 GGGCCC 3 等位基因b5 GTGCCC 3 人群中将形成三种基因型 GGTTGT 杂合子的鉴定可以通过PCR产物酶切后电泳的方法完成 GGTTGT 236bp 173bp 63bp LOI的鉴定可以通过杂合子RT PCR产物酶切后电泳的方法完成 236bp 173bp 63bp 正常 印记 正常 LOI 一 实验安排 实验一基因组DNA的提取 基本原理 常规酚 氯仿抽提法提取基因组DNA的原理在于用蛋白裂解液和蛋白酶将组织充分消化后 再应用酚 氯仿将蛋白质变性 而核酸则溶于水相 再在一定浓度的盐和无水乙醇的作用下将核酸从水相中析出 器材 1 电子天平 2 匀浆器 3 EP管 4 冰盒 5 手套 6 高速离心机 试剂 1 酚 2 氯仿 3 无水乙醇 4 75 乙醇 5 纯水 操作步骤 胃癌组织 洗涤200ulPBS 离心8000rpm5min 消化180ulTE 20ul10 SDS3ul蛋白酶K 50 2h 弃上清留100ul 酚提取300ul酚 离心10000rpm10min 移水相至新管 酚 氯仿抽取150ul酚150ul氯仿 离心10000rpm10min 移水相至新管 沉淀DNA1 10VNaAC 30ul 2V乙醇 600ul 离心10000rpm5min 洗DNA75 乙醇300 l 弃上清 离心8000rpm5min 弃上清 干燥 溶解DNA适量TE 实验二组织总RNA的提取 基本原理 组织中的RNA主要分布在胞浆中 包括mRNA tRNA和rRNA三种 mRNA含量最低 半衰期短 易于降解 在RNA的提取过程中 主要采用强变性剂 如异硫氰酸胍等破坏细胞结构 失活RNA酶 细胞碎片 蛋白质等经酚 氯仿等有机溶剂抽提被去除 真核生物中18SrRNA 28SrRNA经琼脂糖电泳后 在紫外灯下可观察到两条清晰的条带 RNA提取关键 防止内源性和广泛存在的外源性RNA酶 如器皿 试剂和手上等存在的RNA酶对核酸的降解作用 所用材料 器皿均需经DEPC处理 包括0 1 溶液浸泡过夜 蒸馏水冲洗及高压灭菌15min去除残存的DEPC 器材 1 电子天平 2 匀浆器 3 EP管 4 冰盒 5 手套 6 低温冷冻高速离心机 试剂 1 TRIzol试剂 Invitrogen GIBCOBRL 2 氯仿 3 异丙醇 4 75 乙醇 5 0 1 DEPC处理水 提取RNA操作步骤 胃癌组织 制备匀浆200ulTrizol 孵育4 12h 盖上盖后摇动15sec 加氯仿40ul 冰上放置5min 离心12000rpm4 15min 移水相至新管 加异丙醇100ul 冰上孵育10min 离心12000rpm4 10min 弃上清 洗涤沉淀75 乙醇200ul 离心10000rpm4 5min 空气干燥 溶解RNADEPC水20ul 70 保存 实验三反转录聚合酶链反应 RT PCR 基本原理 PCR是体外扩增DNA的方法 但不能直接以RNA为模板扩增 利用反转录酶 RTase 可由mRNA生成cDNA 第一链 以此cDNA为模板即可进行RNA的PCR扩增 如果在PCR反应中 除加入待扩增的特异基因的引物外 再加入常用的 actin或GAPDH引物作为内参基因扩增 则可对特异基因的转录水平进行半定量分析 RT PCR的原理 器材 1 PCR扩增仪 2 恒温水浴箱 3 紫外灯检测仪 4 EP管 5 手套 试剂 1 特异基因引物上游引物 5 CTTGGACTTTGAGTCAAATTGG3 下游引物 5 CCTCCTTTGGTCTTACTGGG3 2 RT PCR试剂盒 Takara公司 操作步骤 一 反转录反应1 在EP管中加入以下反应液 2 按以下条件进行反转录反应 二 PCR反应 1 取上液10 l加入 P管中 再加入下列试剂 混匀后 放入PCR扩增仪中进行扩增 然后用电泳鉴定PCR产物 10 l 2 按以下条件进行PCR反应 实验四限制性酶切及电泳检测 一 限制性酶切 基本原理 SNP的存在导致限制性酶切位点发生改变 根据IGF2基因第9外显子具有限制性核酸内切酶ApaI位点多肽性的特点 RT PCR产物行ApaI消化 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行印迹丢失检测 器材 1 恒温水浴箱 2 EP管 3 手套 试剂 1 ApaI限制性内切酶 2 10 Lbuffer 3 纯水 操作步骤 RT PCR产物酶切体系 37 水浴摇床过夜 1 限制性内切酶消化 2 电泳检测酶切产物10ul与电泳上样缓冲液充分混合 在40mA电流下 2 琼脂糖凝胶电泳 紫外灯下观察杂合子情况 一 琼脂糖凝胶电泳 基本原理 琼脂糖凝胶电泳是分离 纯化 鉴定DNA片段的常用方法 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷 在电场中向正极移动 DNA分子在电场中通过介质而泳动 除电荷效应外 凝胶介质还有分子筛效应 与分子大小及构象有关 对于线性DNA分子 其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比 在凝胶中加入少量溴化乙锭 EB 其分子可插入DNA的碱基之间 因此可在紫外灯下直接观察到DNA片段在凝胶上的位置 并可在紫外灯下或经凝胶成像系统观察或拍照 线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系 器材 1 水平电泳槽 2 电泳仪 3 紫外透射仪或凝胶成像系统 试剂 1 1 琼脂糖 2 电泳缓冲液 1 TBE 3 10mg ml溴化乙锭 EB 4 电泳样品上样缓冲液 6 0 25 溴酚蓝 0 25 二甲苯腈 40 W V 蔗糖水溶液 在40C保存 1 琼脂糖0 2g 加电泳缓冲液 1 TBE 20ml 加热熔化 2 胶液冷至50 C时 加EB2 l 小心混匀 缓慢倒入制胶模具