化学诱导矮败小麦孤雌生殖育种的研究与应用.pdf

化学诱导矮败小麦孤雌生殖育种的研究与应用 孙耀中 董洪平 秦素平 周丽艳 宋金耀 河北科技师范学院生命科学系 河北 昌黎 066600 摘要 根据作者近 10 年的研究与实践 对化学诱导矮败小麦孤雌生殖育种的研究做了比较全 面的阐述 并对化学诱导矮败小麦孤雌生殖育种的应用价值 存在问题及解决途径进行了讨 论 关键词 矮败小麦 化学诱导 孤雌生殖育种 中图分类号 S512 1 文献标识码 A 文章编号 1004 3268 2004 03 0003 04 孤雌生殖是指卵细胞不经过受精而直接形成 胚并发育为个体的单性生殖方式 属无融合生殖 范畴 因为孤雌生殖后代是直接由亲本雌性母细 胞发育而成 所以它保持了亲本的各种性状 并且 能够稳定的遗传下来 对于一个性状优良的品种 系 而言 如果能够以孤雌生殖的方式产生后代 那么其本身所具有的优良性状将能永远保持下 去 育种过程将会大大简化 从而可以省去繁杂的 制种和提纯工作 因此 孤雌生殖在植物育种上 具有非常重要的应用价值 目前 在作物育种上 较为常用的诱导孤雌生殖的方法主要有花粉诱导 法和药剂诱导法 1 花粉诱导法主要是通过远 缘杂交或延迟授粉诱导孤雌生殖 由于亲缘关系 较远的花粉既不易使卵细胞受精 又能刺激卵细 胞单性发育 从而产生单倍体或纯合二倍体的胚 由于延迟授粉 花粉管即使到达胚囊内 卵细胞由 于丧失受精能力也不能受精 从而进行孤雌生殖 药剂诱导法是用化学药剂 如植物生长调节剂 直 接刺激卵细胞 使之分裂诱发孤雌生殖 小麦属 自花授粉作物 且花器较小 用普通小麦作亲本诱 导孤雌生殖 去雄比较麻烦 效率低 并且容易受 到外来花粉的污染 因此 在小麦孤雌生殖育种 上利用雄性不育类型的材料作为亲本诱导孤雌生 殖则可以大大提高工作效率 矮败小麦的问世 为小麦孤雌生殖育种提供了极为理想的亲本材 料 同时 也为小麦孤雌生殖育种开辟了更为广阔 的应用前景 笔者自 1992 年以来 首次利用矮 败小麦轮回选择群体的不育株为亲本进行化学诱 导孤雌生殖育种研究 取得了一定的成果 现将 近 10 年的研究与实践综述如下 1 显性核不育矮败小麦轮回选择改良群体的构 建 显性核不育矮败小麦是显性矮秆基因 Rht10 与显性雄性不育基因 Ms2 的紧密连锁体 其遗传 特点是 不育株接受任一非矮秆父本的花粉 后代 总是分离出一半矮秆不育株和一半高秆可育株 二者在群体中所占的比例为 1 1 不育株具有明 显的标记性状 2 3 根据矮败小麦的这一遗传特 点 自 1992 年开始 对显性核不育矮败小麦进行 群体改良 目的在于构建符合孤雌生殖育种目标 要求的轮回选择改良群体 每年在矮败小麦群体 中选择农艺性状较好的不育株为母本 以当地生 产上推广的小麦优良品种或杂交组合的优良品系 为父本进行杂交 并连续进行回交 从回交后代选 出优良不育株 收获不育株上的异交种子构成下 一年的轮回选择群体 在该轮回选择群体中 有 一半不育株和一半可育株 授粉前去除性状不良 的可育株 让群体随机交配 经过如此多年的重 组和选择 使群体中优良基因和优良基因重组体 的频率得到提高 现已获得一个遗传基础优良的 轮回选择群体 4 13 收稿日期 2003 08 01 基金项目 河北省自然科学基金项目 396280 作者简介 孙耀中 1958 男 河北乐亭人 教授 本科 主要从事作物遗传育种研究 3 2004 年第 3 期 2 化学诱导矮败小麦孤雌生殖的技术要点 在隔离区适期等距点播矮败小麦轮回选择群 体 在拔节 抽穗期以株高为标记性状鉴别植株 育性 去掉可育株 保留不育株 当不育株穗子抽 出旗叶时开始选穗 并做标记 在进行化学诱导 处理前 先整穗 即去掉穗子基部和顶部发育不良 的小穗 留中间发育完全的10 12 个小穗 在进 行诱导处理时 先对每个小穗逐个进行检查 如发 现有子房膨大或柱头受损 萎蔫的小花予以剔除 只处理柱头新鲜 没有授粉迹象的子房 2 1 诱导药剂 研究表明 对氯苯氧乙酸 CPX 秋水仙素 COL 二甲基亚砜 DMSO 马来酰肼 MH 激 动素 KT 聚乙二醇 PEG 2 4 D 烟酸 奈乙 酸 肌醇 赤霉素 GA3 矮壮素 乙烯雌酚 炔诺 酮 甲地孕酮等化学药剂都有诱导孤雌生殖的作 用 但是 不同诱导剂的诱导效果存在较大的差 异 如动物雌性激素 炔诺酮 甲地孕酮和乙烯 雌酚的诱导效果按诱导结实率的大小依次为甲地 孕酮 1 34 炔诺酮 1 01 乙烯雌酚 0 98 同一诱导剂不同浓度的诱导效果也有 较大的差异 如对氯苯氧乙酸以 500 mg L 的诱 导结实率最高 4 6 肌醇以 100 mg L 的诱导 结实率最高 4 2 2 4 D 则以 10 mg L 的诱 导结实率最高 3 4 不同药剂组合存在一定 的互作效应 如秋水仙素和二甲基亚砜对诱导矮 败小麦孤雌生殖不仅具有单独效应 而且还存在 极显著的互作效应 0 2 COL 2 DMSO 和 0 1 COL 2 DMSO 两个处理组合为较优组 合 此外 对氯苯氧乙酸 二甲基亚砜 激动素 赤 霉素等药剂的不同组合 如 500 mg LCPX 100 mg L KT 1 5 DMSO 和 500 mg L CPX 100 mg L KT 1 5 DMSO 100 mg LGA3的诱导 结实率均显著高于对照 5 9 实践证明 可用于诱导矮败小麦孤雌生殖的 化学药剂有多种 但效果较为理想的主要有 0 2 COL 2 DMSO 0 1 COL 2 DMSO 500 mg L CPX 100 mg L KT 2 DMSO 500 mg L CPX 100 mg L KT 1 5 DMSO 500 mg L CPX 100 mg L KT 1 5 DMSO 100 mg L GA3等 2 2 诱导方法 孙耀中等 5 研究了同一诱导剂不同诱导方 法 包括施药方法 用药时间 剪颖和套袋 对孤雌 生殖结实率的影响 结果表明 采用注射法的诱 导结实率高于喷雾法 在用药量 每穗 1 ml 和用 药次数 6 次 相同的情况下 每天上午 7 00 用药 处理的结实率较低 每天下午 7 00 用药处理的结 实率较高 而每天上午 7 00 前和下午 7 00 后都 用药处理的结实率则介于二者之间 在处理时间 上午 7 00 和下午 7 00 和每穗用药量 1 ml 相 同的情况下 连续喷施 6 次的结实率最高 小穗剪 颖 2 3 后再进行诱导处理的结实率比小穗剪颖 1 3 1 2 和不剪颖的都高 因为剪颖深的子房容 易直接接触到药剂的缘故 经过药剂处理后的穗 子套袋比不套袋的结实率高 因为喷药后套袋的 穗子保湿性好 药液损失较少 孙耀中等应用正交试验法 对施药方法 用药 时间 剪颖深度和套袋等 4 个因素对诱导结实率 的影响进行了方差分析 结果表明 在上述 4 个 因素中 剪颖深度对孤雌生殖诱导结实率的影响 最大 其次是施药方法 剪颖与不剪颖对诱导结实 率的影响达到极显著 注射 与 喷雾 对诱导结 实率的影响差异达到显著 用药时间和套袋与否 两个因素的水平变化对孤雌生殖结实率的影响差 异均未达到显著 8 试验结果证明 较为理想的诱导方法为 小穗 剪颖 2 3 不伤柱头为宜 后 每天下午 7 00 将药 液注射到颖花内 经过药剂处理过的穗子以套袋 为佳 2 3 孤雌生殖幼胚的离体培养 经过研究发现 不育株经化学药剂诱导之后 有的子房明显的膨大并形成胚乳 但不能发育成 胚 有的虽然能够发育成胚 但胚乳发育不良 形 成干瘪种子 最后不能出苗或出苗后即夭折 从而 导致孤雌生殖的诱导频率较低 为了解决这一难 题 孙耀中等 10 13 采用田间诱导处理和室内幼胚 离体培养相结合的方法 简称幼胚拯救法 显著 地提高了孤雌生殖诱导频率 其方法是 在田间 诱导处理后20 d 将不育穗取回室内 在无菌条件 下剥出幼胚或胚组织 直接接种在培养基上进行 离体培养 在诱导处理的 1 200 朵小花中 成苗 率达到 3 25 与田间诱导处理的成苗率 1 42 4 河南农业科学 相比 差异达到极显著 由此可见 采用田间诱导处理和室内幼胚离 体培养相结合的方法是提高矮败小麦孤雌生殖诱 导频率的一种有效的途径 3 孤雌生殖子房发育机理的研究 3 1 孤雌生殖子房发育的胚胎学研究 关于化学诱导矮败小麦孤雌生殖种子形成的 机理 迄今为止仍处于探索阶段 秦素平等用 500 mg L CPX 100 mg L KT 1 5 DMSO 为 诱导剂处理矮败小麦不育株的子房 以蒸馏水处 理为对照 诱导其孤雌生殖 用石蜡切片法观察 子房的发育进程 结果表明 经过化学药剂诱导 处理的子房 在发育初期 随着子房体积逐渐增 大 胚囊内八核体积也随之增大 但到了发育后 期 子房的发育则朝两个方向发展 其一 胚囊内 的细胞逐渐解体 子房壁逐渐变薄 最后仅剩一薄 层子房壁 胚囊内形成一个空腔 最后子房萎蔫 其二 胚囊内的细胞逐渐解体 子房壁逐渐变薄 但胚囊内靠近珠心内侧有胚乳细胞出现 这是由 于子房受到化学药剂的刺激 使珠心的一些细胞 发育形成胚乳细胞 这样的子房可进一步发育形 成孤雌生殖后代 未经化学药剂诱导处理 对照 的子房 胚囊内的八核逐渐解体 无胚和胚乳细胞 出现 最后子房萎蔫 11 上述结果表明 矮败小麦不育株的子房通过 化学药剂的刺激 可使胚囊内的某些珠心细胞发 育形成胚乳细胞 进而形成孤雌生殖后代的胚 3 2 孤雌生殖子房发育过程中几种生化指标的 变化 秦素平等研究发现 经过化学药剂诱导处理 的子房 在发育初期 子房内的蛋白质含量 氨基 酸含量 葡萄糖含量 蔗糖转化酶活性 谷丙转氨 酶活性 过氧化物酶活性和呼吸强度都明显高于 对照处理和正常授粉的子房 而到了发育后期 随 着子房的退化 子房内的上述生化指标则呈明显 下降趋势 分析其原因 主要是因为经过化学药 剂诱导处理的子房 由于外源激素的影响 在发育 初期合成高分子化合物的速度加快 以后 随着外 源激素作用的逐渐减弱 合成高分子化合物的速 度也随之减慢 相反 对照处理和正常授粉的子 房 由于在发育初期子房的内源激素合成较慢 子 房自身合成的高分子化合物含量相对较低 而到 了发育后期 随着子房的进一步发育 子房的内源 激素合成加快 各种高分子化合物含量也随之增 加 从子房的发育进程和上述 3 种酶活性的变化 看 酶活性下降的速度明显快于子房的退化速 度 12 可见 经过化学诱导处理的子房 能否继续发 育 不仅与子房内合成的蛋白质 氨基酸和葡萄糖 含量有关 而且也与子房内的蔗糖转化酶 谷丙转 氨酶 过氧化物酶等酶的活性变化有着密切的关 系 4 孤雌生殖后代的鉴定 4 1 田间及室内鉴定 通过化学诱导获得的种子为孤雌生殖当代 孤雌生殖的种子一般比较瘦瘪 生活力较弱 出苗 率低 幼苗长势较正常授粉的种子弱 将孤雌生 殖的种子按单粒点播在试验田 长成的植株自交 结实形成第 1 代 当年再将其按株行种植 从出苗 到成熟观察各株行内株间的主要性状 如出苗率 幼苗成活率 植株育性 株型 叶型 穗型 芒 花 药 花丝 株高 生育期等 表现是否一致 对株高 穗长 小穗数 穗粒数和千粒重等数量性状进行室 内考种和数理统计分析 凡上述性状表现型一 致 同时株高 穗长 小穗数 穗粒数 千粒重的变 异系数均接近于对照品种 当地生产上推广品种 时 则定为孤雌生殖纯系 6 8 4 2 生化鉴定 利用 POD同工酶或醇溶蛋白电泳分析 分析 孤雌生殖第 1 代不同个体的酶谱 通过酶带的一 致性判断是否为孤雌生殖纯系 14 实践证明 通过上述鉴定方法 可有效地筛选 出农艺性状优良 且符合育种目标要求的孤雌生 殖纯系 5 化学诱导矮败小麦孤雌生殖在育种上的应用 前景 化学诱导矮败小麦孤雌生殖在育种上具有非 常重要的应用价值和广阔的应用前景 主要表现 在 矮败小麦不育株为杂合体 具有丰富的遗传 基础 由它产生的细胞一半含有不育基因 一半含 有可育基因 经过诱导所产生的孤雌生殖后代仍 5 2004 年第 3 期 会出现一半的可育株 从中可以筛选出性状优良 的可育后代 诱导矮败小麦孤雌生殖 可以先 向不育株中有目的地输入符合育种目标要求的种 质 然后再诱导其孤雌生殖 这样可以尽快获得理 想的稳定品系 从而缩短育种进程 与常规育种方法相比 获得纯系的时间大大缩短 从而可以缩短育种周 期 加快育种进程 6 问题与展望 6 1 最佳诱导剂和最适浓度问题 经过几年的试验 虽然已筛选出了一些诱导 效果较好并且药效比较稳定的诱导剂和浓度 但 是诱导频率偏低 尚未达到预期的效果 因此 进 一步筛选最佳诱导剂和浓度 提高孤雌生殖诱导 频率 仍是今后重点研究的内容 6 2 化学诱导矮败小麦孤雌生殖的机理问题 因为化学药剂诱导矮败小麦孤雌生殖频率较 低 所以研究化学诱导孤雌生殖种子形成的机理 有一定的难度 笔者仅对化学诱导子房发育过程 做了初步的探讨 且由于取样量较小 所得结果还 有待进一步验证 因此 进一步寻求更有效的研 究手段与方法也是今后需要探讨的问题 综上所述 化学诱导矮败小麦孤雌生殖的技 术为小麦无融合生殖育种开辟了一条新途径 并 已展现出诱人的应用前景 但是 该项技术还有 待进一步深入研究 寻找更有效的诱导剂 最佳的 浓度和诱导方法 探明孤雌生殖的诱导机理 使之 更趋完善 以便在小麦育种上得到广泛的推广和 应用 参考文献 1 辛淑荣 高建伟 颜廷进 活体诱导植物孤雌生殖研 究进展 J 莱阳农学院学报 1995 12 2 112 117 2 刘秉华 杨丽 王山荭 矮败小麦的遗传研究 J 作 物学报 1994 20 3 306 307 3 刘秉华 杨丽 王山荭 矮败小麦及应用途径分析 J 华北农学报 1994 9 1 306 309 4 孙耀中 董洪平 隔离区内诱导显性核不育小麦孤 雌生殖的研究 J 北京农业大学学报 1993 19 增 刊 110 112 5 孙耀中 董洪平 秦素平 显性核不育小麦孤雌生殖 诱导方法的研究 J 河北农业技术师范学院学报 1994 8 2 1 5 6 孙耀中 董洪平 隔离区内化学诱导显性核不育小 麦孤雌生殖的研究 J 华北农学报 1995 10 1 11 15 7 孙