糖尿病研究模型PPT课件.ppt

糖尿病药理学研究方法 1 目录 糖尿病的发病机制 糖尿病的治疗靶点 糖尿病的模型 糖尿病的药理学研究方法 2 什么是糖尿病 糖尿病 diabetesmellitus 是一组以高血糖为特征的代谢性疾病 高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损 或两者兼有引起 糖尿病时长期存在的高血糖 导致各种组织 特别是眼 肾 心脏 血管 神经的慢性损害 功能障碍 糖尿病的发病机制 3 分型1型糖尿病 由于胰岛 细胞破坏而导致内生胰岛素绝对缺乏 2型糖尿病 不同程度的胰岛素分泌障碍和胰岛素抵抗并存的疾病 糖尿病的发病机制 4 表现 三多一少 糖尿病的发病机制 糖尿病的并发症 5 1型糖尿病 免疫系统缺陷和遗传等因素 童年时期就发病 终身注射胰岛素 2型糖尿病 高糖素样多肽一 胰腺中的胰岛 胰岛素受体的功能障碍 后期发病 糖尿病的发病机制 6 糖尿病的发病机制 小肠中的多肽一发现血糖水平升高 报告给胰腺 胰腺通知胰岛分泌胰岛素 胰岛素在胰岛素受体的配合下降低血糖 7 糖尿病的发病机制 肥胖导致的糖尿病 8 糖尿病的治疗靶点 9 体外研究模型基于靶点的细胞模型基于表型的细胞模型体内研究模型正常动物糖尿病模型自发性糖尿病动物模型实验性糖尿病动物模型基因工程糖尿病动物模型 糖尿病的模型 10 基于靶点的细胞模型以受体为靶点的细胞模型以胰岛素信号通路为靶点的细胞模型以钙通道和KATP通道为靶点的细胞模型基于表型的细胞模型胰岛素抵抗细胞模型葡萄糖消耗运转细胞模型 糖尿病体外研究模型 11 GLP 1的生理作用 以受体为靶点的细胞模型 GLP 1受体 cAMP GLP 1受体细胞模型 膜受体 GLP 1 核受体 PPAR 12 以胰岛素信号通路为靶点的细胞模型 胰岛素信号通路 报告基因技术 13 以钙通道和KATP通道为靶点的细胞模型 钙离子信通路 膜片钳系统 14 膜片钳技术 膜片钳的原理 15 胰岛素抵抗细胞模型 细胞HepG 肝胚胎瘤细胞3T3 L1 脂肪纤维细胞C2C12 成肌细胞 造模处理 高浓度胰岛素高糖高脂地塞米松衣霉素棕榈酸 检测指标 细胞活性葡萄糖消耗量 16 葡萄糖消耗运转细胞模型 培养液 葡萄糖 氚标葡萄糖 培养 液闪仪检测 17 葡萄糖消耗运转细胞模型 培养液 葡萄糖 培养 葡萄糖检测 细胞量检测 18 葡萄糖氧化酶法己糖激酶法血糖仪检测连续式血糖检测仪无创式血糖监测 血糖的检测方法 19 检测原理 葡萄糖氧化酶法 20 己糖激酶法 在己糖激酶催化下 葡萄糖和三磷腺苷 ATP 发生磷酸化反应 生成葡萄糖 6 磷酸 G 6 P 与二磷酸腺苷 ADP 前者在葡萄糖 6 磷酸脱氢酶 G 6 PD 催化下脱氢 生成6 磷酸葡萄糖酸 6 GP 同时使氧化型辅酶 NADP 还原成还原型辅酶 NADH NADH的生成速率与葡萄糖浓度呈正比 NADH在340nm有特异吸收峰 在波长340nm处监测吸光度升高速率 计算血清中葡萄糖浓度 21 血糖仪检测 全自动生化仪 22 血糖仪检测 23 连续式血糖检测仪 2018年 美国FDA批准Senseonics公司的Eversense连续血糖监测 CGM 系统用于18岁以上的糖尿病患者 完全植入 可用90天的血糖检测传感器的CGM系统 24 无创式血糖监测 根据其工作原理 可分为下列四类 利用皮下间质液中的糖分子测试血糖值 皮下间质液可以有少量渗出皮肤 无创得到皮下间质液样品 测得血糖值 通过人体对近红外线 中红外线或远红外线的频谱分析 提取血糖值 当用红外线照射人体时 代表血糖特征的反射或吸收红外线 称为血糖特征频谱信号 可用来提取血糖值 测试人体的射频阻抗 提取血糖值 当波长较红外线更长的电磁波对人体辐射时 像血糖这种非离子可溶性物质 将吸收一定的电磁波 提取其吸收特征值 理论上可以得到血糖值 根据糖尿病人血液中糖化蛋白比例较高这一特征 通过对眼球测试 得到血糖值 25 糖尿病体内研究模型 体内研究模型正常动物糖尿病模型自发性糖尿病动物模型实验性糖尿病动物模型基因工程糖尿病动物模型 26 正常动物糖尿病模型 以正常动物为实验对象 对给药后动物体内葡萄糖的浓度变化进行研究的模型 特点 影响因素较少 可直接反应药物的降糖作用 缺点是非病理模型 不能反映对疾病的治疗作用 常用的模型 糖耐量试验糖钳试验 27 实验动物 大鼠 小鼠 糖耐量试验 给药 大 小鼠 给葡萄糖5g kg 眼眶采血 颈静脉采血 剪尾采血 28 糖耐量试验 葡萄糖检测 如何判断抗糖尿病药物的治疗效果 29 糖耐量试验 CmaxAUC 30 AUC的计算 梯形法积分法 31 糖耐量试验 32 糖钳实验 葡萄糖钳夹技术 Glucoseclamptechnique 是一种定量检测胰岛素分泌和胰岛素抵抗的方法 被认为是现今最新的葡萄糖稳态的测量技术 葡糖钳分类高胰岛素 正常血糖钳夹通过外周静脉灌注 使受试者血清胰岛素水平上升并维持在约100muU ml 给予受试者20 葡萄糖的灌注 且使得血糖浓度维持在正常水平 可以用于评估外周组织对胰岛素的敏感性 高葡萄糖变量钳夹通过血糖灌注使受试者血糖水平上升维持在7 0mmol L 通过检测保持在高水平血糖情况下葡萄糖的灌注量 从而评价葡萄糖代谢率 可以评价 细胞对葡萄糖的敏感性 33 血糖升高时 胰岛素分泌增加 并通过增加摄取 存储和利用葡萄糖等方式 下调血糖 血糖下降 胰岛素分泌降低 胰高血糖素等升糖激素增加 促进代谢分解 加速糖原分解和葡萄糖异生作用 升高血糖 技术原理 1 葡萄糖 胰岛素负反馈体系 34 正糖钳技术通过同时输注可控浓度及速率的外源性胰岛素和葡萄糖 打破体内葡萄糖一胰岛素的负反馈调控 使血浆外源性胰岛素维持在较高浓度水平 而血糖维持在基础稳态水平 技术原理 2 钳夹技术原理 由于血浆外源性胰岛素的优势浓度 抑制了内源性葡萄糖 肝糖分解和糖异生 和内源性胰岛素分泌 此时外源性葡蔔糖输注速率等于外周组织的葡萄糖利用率 从而评价葡萄糖 胰岛素以及其他相关物质的代谢过程 35 1 避免内源性胰岛素缺乏 如糖尿病患者 及低血糖对胰岛素敏感性测定的影响 2 将内源性干扰减至最小 增加了实验的可控性与准确性 降低了结果的变异性 实验技术特点 1 不同受试者的应激反应和血管紧张度等诸多因素会对稳态的建立产生一定的影响 2 该技术复杂耗时 费用昂贵 实验中需频繁取血 优点 缺点 36 犬禁食12h后 称重 测血糖 犬糖钳实验 开通静脉通道 与三通管相连 一进口端输注胰岛素 另一进口端输注10 葡萄糖 分别从静脉恒速输注胰岛素和10 葡蔔糖溶液 每隔10min取血测定血糖 根据所测血糖值调整葡萄糖输注速率至稳态 37 犬糖钳实验 38 自发性糖尿病动物模型 表现为高血糖 胰岛素抵抗 动物来源相对较少 未经任何的人工处理 自然状态下发生 模型更接近人类糖尿病的自然起病及发展 饲养 繁殖条件要求高 动物昂贵 模型特点 模型不足 自发性糖尿病小鼠模型是指未经任何有意识的人为处置 在自然条件下发生糖尿病的小鼠模型 39 自发性糖尿病动物模型 40 自发性糖尿病动物模型 db db小鼠美国Jackson实验室于1966年发现的位于4号染色体的Leptin受体基因缺陷导致的自发性2型糖尿病小鼠 从四周龄即出现贪食 肥胖 随周龄增加而出现明显的高血糖 高血脂 胰岛素抵抗等特征 其发病过程与2型糖尿病患者非常相似 41 自发性糖尿病动物模型 ob ob小鼠带有ob基因 obese 为6号染色体隐性基因 纯合子导致单纯肥胖伴晚期糖尿病 2周龄时肥胖个体外表上有别于正常个体 在8 9月龄时 动物体重增加到最大值 约为70克 多种代谢失调 包括脂肪形成增加 脂肪分解减少 代谢失调与过食症和胰岛素分泌过多有关 动物在6 9周龄时有中度的高血糖 但12 16周后自发消失 肥胖症与人类的肥胖症相似 用于肥胖症的生化 症理 激素及药物治疗等的研究 42 实验性糖尿病动物模型 实验性糖尿病动物模型是指通过物理 生物 化学等致病因素人工诱发出的具有糖尿病特征的动物模型 具有耗时短 方法简便 易于掌握 重复性好的特点 短期内可诱导出大量模型 43 实验性糖尿病动物模型 手术诱导饮食诱导化学药物诱导联合诱导 44 实验性糖尿病动物模型 手术诱导 手术诱导动物 一般选用较大型动物 如犬 家兔 其次大鼠 一般切除90 的胰腺 保留部分胰腺功能 出现多尿 多饮 多食等严重糖尿病症状 缺点手术技巧术后护理 45 实验性糖尿病动物模型 饮食诱导 饮食诱导动物 大鼠 小鼠 高脂高糖饲料喂养 动物表现为肥胖 糖耐量受损 胰岛素抵抗和脂代谢异常 缺点 造模时间长 4 5个月以上 成本高 普通饲料 猪油 蔗糖 胆固醇 胆酸盐 46 实验性糖尿病动物模型 饮食诱导 47 实验性糖尿病动物模型 化学药物诱导 链脲佐菌素 Streptozotocin STZ STZ通过自由基损伤 细胞 使 细胞功能受损 胰岛素合成减少 引发糖尿病 四氧嘧啶 alloxan 四氧嘧啶产生超氧自由基而破坏 细胞 导致胰岛素合成减少 胰岛素缺乏 其作用可能与干扰锌的代谢有关 48 实验性糖尿病动物模型 化学药物诱导 动物选择 推荐大鼠170 200g 小鼠17 22g 雄性动物 大鼠推荐用SD 小鼠推荐C57 造模前喂以高脂高糖饲料4 6周 诱发出胰岛素抵抗 再注射小剂量STZ 禁食12h以上 一般过夜禁食 不禁水 禁食的时间越长 STZ对胰岛 细胞的破坏力越明显 大 小鼠 腹腔注射STZ 检测血糖 动物筛选分组给药实验 49 实验性糖尿病动物模型 化学药物诱导 一般症状 糖尿病小鼠体重变轻 精神萎靡 反应迟钝 毛竖无光泽 动作迟缓 弓背捲体 尿量显著增加 50 组织病理学变化正常小鼠 胰岛排列呈团索状 边缘规则 数目多 胰岛细胞无坏死 胰岛周围及胰岛内无炎细胞浸润 糖尿病小鼠 胰岛数目减少 胰岛周围及胰岛内出现炎症 实验性糖尿病动物模型 化学药物诱导 51 实验性糖尿病动物模型 联合诱导 手术及药物联合制作糖尿病模型 手术切除实验动物胰腺钩突及体尾部 局部应用