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病原微生物危害评估 王健伟中国医学科学院病原生物学研究所 1 4生物危害评估当实验室活动涉及传染或潜在传染性生物因子时 应进行危害程度评估 危害程度评估应至少包括下列内容 生物因子的种类 已知的 未知的 基因修饰的或未知传染性的生物材料 来源 传染性 致病性 传播途径 在环境中的稳定性 感染剂量 浓度 动物实验数据 预防和治疗 危害程度评估应由适当的有经验的专业人员进行 中华人民共和国国家标准 GB19489 2004 实验室生物安全通用要求 2 一 病原微生物危害程度分类 3 病原微生物危害程度分类 危害程度分类是病原微生物危险评价的主要依据之一 危害类别的高低是根据病原微生物对个体和群体的感染后可能产生的相对危害程度来划分的 由于病原微生物在不同国家流行的状况不同 因此 不同国家根据病原微生物的传染性 感染后对个体或者群体的危害程度以及流行状态并考虑是否具有有效的预防治疗措施等因素 来划分各自的微生物危害程度分类 4 病原微生物实验室生物安全管理条例 第四条国家对病原微生物实行分类管理 对实验室实行分级管理 第五条国家实行统一的实验室生物安全标准 实验室应当符合国家标准和要求 第二十一条一级 二级实验室不得从事高致病性病原微生物实验活动 5 第八条人间传染的病原微生物名录由国务院卫生主管部门商国务院有关部门后制定 调整并予以公布 动物间传染的病原微生物名录由国务院兽医主管部门商国务院有关部门后制定 调整并予以公布 病原微生物实验室生物安全管理条例 6 病原微生物危害程度分类主要依据 微生物的致病性 致病性越强 导致的疾病越严重 其等级越高 微生物的传播方式和宿主范围 它们可能会受到当地人群已有的免疫水平 宿主群体的密度和流动 适宜媒介的存在以及环境卫生水平等因素的影响 当地所具备的有效预防措施 包括 通过接种疫苗或给予抗血清的预防 被动免疫 卫生措施 例如食品和饮水的卫生 动物宿主或节肢动物媒介的控制 当地所具备的有效治疗措施 包括 被动免疫 暴露后接种疫苗以及使用抗生素 抗病毒药物和化学治疗药物 还应考虑出现耐药菌株的可能性 7 病原微生物实验室生物安全管理条例 第七条国家根据病原微生物的传染性 感染后对个体或者群体的危害程度 将病原微生物分为四类 第一类病原微生物 是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物 以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物 第二类病原微生物 是指能够引起人类或者动物严重疾病 比较容易直接或者间接在人与人 动物与人 动物与动物间传播的微生物 第三类病原微生物 是指能够引起人类或者动物疾病 但一般情况下对人 动物或者环境不构成严重危害 传播风险有限 实验室感染后很少引起严重疾病 并且具备有效治疗和预防措施的微生物 第四类病原微生物 是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物 第一类 第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物 8 9 10 根据 条例 的有关要求 为规范人间传染的病原微生物的实验操作 确保实验室生物安全 卫生部组织制订了 人间传染的病原微生物名录 已于2006年1月11日下发 11 一 名录 编写说明 12 编写原则 参照我国 病原微生物实验室生物安全管理条例 的病原微生物的分级标准尽量全面 体现实验活动 满足不同需要吸收发达国家的先进经验和惯例紧密结合国内的实际 物质 技术 人员 便于查找 注重实用广泛听取不同意见 13 涉及病原微生物 法定报告传染病所涉及的病原微生物法定报告传染病以外常见传染病病原微生物国外新发现和已消灭传染病病原微生物 病毒细菌放线菌衣原体支原体立克次体螺旋体真菌 14 参考主要资料 生物医学与微生物实验室生物安全手册 美国CDC NIH 1999 重组DNA分子相关研究指南 美国NIH 1997 实验室生物安全指南 加拿大 1996 欧洲经济共同体 EEC 委员会指令93 88 1996 病原体的分类 比利时 1997 澳大利亚 1995 15 有关说明 国外新发现 我国尚未发现 传染病病原体的操作级别完全按照国外同类标准非法定传染病病原微生物的操作级别主要参照国际相关标准本规定中所涉及病毒的操作级别主要指野生型病原微生物 重组体另加说明 16 有关说明 根据国内的实际情况 有些病原体的防护标准低于国外 17 二 有关实验活动分类的说明 18 名录 的结构 共3个表格 表1病毒 附朊病毒 表2细菌 放线菌 衣原体 支原体 立克次体 螺旋体 表3真菌每个表格后面有说明和注释 使用前应仔细阅读 19 20 病毒培养 指病毒的分离 培养 滴定 中和试验 活病毒及其蛋白纯化 病毒冻干以及产生活病毒的重组试验等操作 利用活病毒或其感染细胞 或细胞提取物 不经灭活进行的生化分析 血清学检测 免疫学检测等操作视同病毒培养 使用病毒培养物提取核酸 裂解剂或灭活剂的加入必须在与病毒培养等同级别的实验室和防护条件下进行 裂解剂或灭活剂加入后可比照未经培养的感染性材料的防护等级进行操作 动物感染实验 指以活病原微生物感染动物的实验 有关说明 21 未经培养的感染性材料的操作 指未经培养的感染性材料在采用可靠的方法灭活前进行的病毒抗原检测 血清学检测 核酸检测 生化分析等操作 灭活材料的操作 指感染性材料或活病毒在采用可靠的方法灭活后进行的病毒抗原检测 血清学检测 核酸检测 生化分析 分子生物学实验等不含致病性活病毒的操作 无感染性材料的操作 指针对确认无感染性的材料的各种操作 包括但不限于无感染性的病毒DNA或cDNA操作 22 脊髓灰质炎病毒这里只是列出一般指导性原则 目前对于脊髓灰质炎病毒野毒株的操作应遵从卫生部有关规定 对于疫苗株按3类病原微生物的防护要求进行操作 病毒培养的防护条件为BSL 2 动物感染为ABSL 2 未经培养的感染性材料的操作在BSL 2 灭活和无感染性材料的操作均为BSL 1 疫苗衍生毒株 VDPV 病毒培养的防护条件为BSL 2 动物感染为ABSL 3 未经培养的感染性材料的操作在BSL 2 灭活和无感染性材料的操作均为BSL 1 上述指导原则会随着全球消灭脊髓灰质炎病毒的进展状况而有所改变 新的指导原则按新规定执行 23 在保证安全的前提下 对临床和现场的未知样本检测操作可在BSL 2或以上防护级别的实验室进行 涉及病毒分离培养的操作 应加强个体防护和环境保护 要密切注意流行病学动态和临床表现 判断是否存在高致病性病原体 若判定为疑似高致病性病原体 应在相应生物安全级别的实验室开展工作 对未知样本的操作 24 本表未列出之病毒和实验活动 由各单位的生物安全委员会负责危害程度评估 确定相应的生物安全防护级别 如涉及高致病性病毒及其相关实验的应经国家病原微生物实验室生物安全专家委员会论证 未列出的病原微生物 25 在卫生部发布有关的管理规定之前 对于人类病毒的重组体 包括对病毒的基因缺失 插入 突变等修饰以及将病毒作为外源基因的表达载体 暂时遵循以下原则 1 严禁两个不同病原体之间进行完整基因组的重组 2 对于对人类致病的病毒 如存在疫苗株 只允许用疫苗株为外源基因表达载体 如脊髓灰质炎病毒 麻疹病毒 乙型脑炎病毒等 3 对于一般情况下即具有复制能力的重组活病毒 其操作时的防护条件应不低于其母本病毒 对于条件复制型或复制缺陷型病毒可降低防护条件 但不得低于BSL 2的防护条件 例如来源于HIV的慢病毒载体 为双基因缺失载体 可在BSL 2实验室操作 使用人类病原微生物的重组体 26 4 对于病毒作为表达载体 其防护水平总体上应根据其母本病毒的危害等级及防护要求进行操作 但是将高致病性病毒的基因重组入具有复制能力的同科低致病性病毒载体时 原则上应根据高致病性病原体的危害等级和防护条件进行操作 在证明重组体无危害后 可视情降低防护等级 5 对于复制型重组病毒的制作事先要进行危险性评估 并得到所在单位生物安全委员会批准 对于高致病性病原体重组体或有可能制造出高致病性病原体的操作应经国家病原微生物实验室生物安全专家委员会论证 27 国家正式批准的生物制品疫苗生产用减毒 弱毒毒种的分类地位另行规定 生物制品用菌毒种 28 朊病毒 Prion 29 30 大量活菌操作 实验操作涉及 大量 病原菌的制备 或易产生气溶胶的实验操作 如病原菌离心 冻干等 大量 的病原菌制备 是指病原菌的体积或浓度 大大超过了常规检测所需要的量 比如在大规模发酵 抗原和疫苗生产 病原菌进一步鉴定以及科研活动中 病原菌增殖和浓缩所需要处理的剂量 样本检测 包括样本的病原菌分离纯化 药物敏感性实验 生化鉴定 免疫学实验 PCR核酸提取 涂片 显微观察等初步检测活动 霍乱弧菌 因属甲类传染病 流行株按第二类管理 涉及大量活菌培养等工作可在BSL 2实验室进行 非流行株归第三类 有关细菌 真菌实验活动的说明 31 名录 只是一种指南 谨供参考 是最基本的要求 不可能涵盖所有的实验活动 各单位应根据实验活动的具体情况 对实验活动的危害进行再评估和实时评估 以采取适当的防护措施 确保生物安全 名录 将根据国内外的进展和变化不断进行修订 在使用中应密切注意卫生部的各种公告 通知以及 名录 的版本变化 32 二 危害评估的内容 33 危害程度评估的要素 一 危害程度分类 二 病原微生物背景资料 三 拟从事实验活动的危险分析 四 评估结论 34 一 病原微生物的背景资料 病原微生物的致病性和感染数量暴露的潜在后果自然传播途径病原微生物在环境中的稳定性病原微生物的宿主从动物研究和实验室感染报告或临床报告中得到的信息当地是否能进行有效的预防或治疗 35 不同病原微生物的致病力强弱不同 即使同类病原微生物不同菌 毒株也还可以有不同强度的致病力 高致病性病原微生物低感染剂量就可导致发病 同一微生物感染数量越大 其暴露的潜在后果也越严重 微生物对感染个体的致病性与被感染者的体质 免疫状态以及对该病原微生物的易感性有关 病原微生物的致病性和感染数量 36 暴露以后 后果的轻重取决于病原微生物的致病力和机体的抵抗力 不同属 种 亚种 型的病原微生物 甚至不同株的病原微生物 其致病性各异 还取决于所感染病原微生物的数量 当大量病原微生物侵袭人体时 潜伏期一般较短 而病情则较为严重 反之 则潜伏期较长而病情较轻 或不发病 不同个体被传染后 可产生各种不同的结局 最轻的不出现任何症状 最重的发生严重型临床疾病而死亡 对暴露的潜在后果评估 应参考教科书并收集相关资料 突出个体传染过程与结局 隐性感染或不显性感染或亚临床感染 显性感染或临床传染病 是否出现个体最严重的结局 发生严重临床传染病而死亡 是否出现个体间的传播 2 暴露的潜在后果 37 病原微生物可通过空气 水 食物 接触 血液 母婴 虫媒 土壤等途径传播 每一种传染病的传播途径不一定相同 同一种传染病在各个具体病例中的传播途径也可以不同 同一种病原微生物也可以有一种以上的传播途径 通过呼吸道传播的病原微生物容易引起不同的感染性疾病 因此 气溶胶是引起实验室感染的最重要因素 3 自然传播途径 38 病原微生物的稳定性是指其抵抗外界环境的存活能力 病原微生物为了维持其种系的生存 可凭借其自身的结构特点以应对外界不利的环境 不同的微生物的稳定性不同 对病原微生物的稳定性评估除考虑其在自然界中的稳定性外 还应考虑其对物理因素与化学消毒剂的敏感性 4 病原微生物在环境中的稳定性 39 5 病原微生物的宿主 应确定拟操作病原微生物的宿主 同时应注意收集该病原微生物对实验室常用的实验动物的感染性的相关资料 40 6 从动物研究和实验室感染报告或临床报告中得到的信息 在某些病原微生物或待检样品危害程度相关背景信息量不足时 应尽可能从病人医学资料 流行病学资料以及样品来源地收集有用的信息 同时可以利用动物致病性 传染性和传播途径的研究数据获取对危害评估有用的信息 41 应收集拟操作的病原微生物的相关治疗与预防措施资料 确定 是否有有效的抗生素 抗病毒药物 化学药物和抗血清等治疗药物和其他与该疾病有效的治疗措施 是否有针对该传染病的疫苗 同时应考虑该疾病是否有典型的体征和可靠的诊断试剂 以用于疾病监测 在查出可能感染时能及时进行有效的隔离与预防 还应考虑 当地 是否有条件进行上述有效的预防或治疗 7 当地是否能进行有效的预防或治疗 42 二 拟从事实验活动的危险分析 操作所致的非自然途径感染病原微生物的种类 来源操作病原微生物的浓度实验操作涉及动物的病原微生物实验工作人员的素质 43 因实验操作而造成非自然途径感染的机会是很多 例如 对感染性材料的清除污染和处理可能导致手污染 微生物操作中释放的较大粒子和液滴 直径大于5 m 会迅速沉降到工作台面和操作者的手上 由于手被污染而导致感染性物质的食入或皮肤和眼睛的污染 破损玻璃器皿的刺伤 使用注射器操作不当可能扎伤而引起经血液感染 血清样本采集时可能喷溅和气溶胶可产生呼吸道感染或误入眼睛而发生粘膜感染 进行动物实验时被动物咬伤 抓伤可导致感染 1 操作所致的非自然途径感染 44 2 病原微生物的种类 不同属 种 亚种 型的病原微生物 甚至不同株的病原微生物 其致病性各异 因此进行危害评估时应考虑相关因素 另外还要考虑是否为重组毒株 45 3 病原微生物的浓度 所操作病原微生物的浓度和其可能产生的危害程度密切相关 对病原微生物的操作的危险性通常涉及操作的病原微生物的生长状况以及病原微生物的数量和浓度 样本的类型 纯培养物 固体组织标本 血标本 痰标本等 以及实验操作等因素 必须对要进行的实验操作进行评估 选择与危险性适合的操作技术 防扩散仪器和设施 46 拟进行病原微生物实验的具体实验项目 该项目哪些实验步骤可能导致气溶胶产生或对操作者造成危害 采用何种预防措施可规避危险 同时应该将该项评估的内容作为制定实验活动标准操作程序 SOP 的重要依据 并尽可能制定与SOP对应的表格化操作原始记录 以保证防范措施能正确实施 4 拟进行的实验操作 47 5 涉及动物的病原微生物实验 动物实验室涉及病原微生物 需要考虑的因素包括 正常传播途径 使用的容量和浓度 接种途径 能否和以何种途径被排出 关于动物实验室中使用的动物 需要考虑的因素包括 动物的自然特性 亦即动物的攻击性和抓咬倾向性 自然存在的体内外寄生虫 易感的动物疾病 播散过敏原的可能性等 对使用野外捕捉的野生动物应考虑潜伏感染的可能性 48 应对所有涉及病原微生物操作的工作人员的知识背景 工作经验 工作能力 个人心理素质以及健康状态进行评估 对实验室管理者还应进行管理能力与处理紧急事故能力的测评 6 工作人员的素质 49 三 评估结论应考虑的要点 各种实验活动的危害程度及其防护措施 感染控制与医疗监测方案应采取的消毒灭菌方案 50 得出评估结论主要步骤 根据实验的内容与对各实验环节的分析 明确危害来源和危害因素 进行固有风险评估 即未采取任何控制措施之前 如果事故发生可能面临的风险 确定危害产生的后果和产生后果的可能性 在评估中后果的严重程度是重要指标 对可能产生灾难性后果的 无论发生频率多低 均视为高度风险 危害发生可能性的高低也应予以重视 一些产生后果不严重但发生几率大的危害 也属于高度风险 对高度风险的需要立即采取行动 对中度风险的必须明确后续处理时各人的职责 对低度风险的采用常规程序处理 进行残余风险评估 即采用旨在降低风险的控制措施后仍然存在的风险因素 列出表格上登录的针对每项危险因素的现有控制措施 进行评估和监督检查 以确定现有控制措施的可靠性 确定残余风险 在采取有效风险控制措施后 如效果很好可使固有高风险降低为中等风险 如果固有风险控制措施不足 则固有低风险潜在危险将增大 残余风险是高度的立即给予关注并解决 残余风险是中度的应制定改进措施短期内给予解决 残余风险是轻度的要长期给予关注 51 三 针对不同类型实验活动危害评估的原则 52 对于同一病原微生物而言 从事不同的实验活动 操作者接触微生物的数量 浓度 可能的感染途径是不同的 一旦暴露 其后果也是不同的 所以对于不同的实验活动均应进行危害评估 以指导操作者采取合适的生物安全防护 53 对使用已分离并鉴定的 或来源清晰的购买或赠送的病原微生物 可根据对该病原微生物实验室研究 疾病监测和流行病学研究以及相关教科书或其他资料进行危害评价 一 含已知的病原微生物的物质 54 在待检样品信息不足时 可以利用病人的医学资料 流行病学资料 发病率和病死率资料 可疑的传播途径 其他有关暴发的调查资料 以及有关标本来源地的信息 帮助确定处理这些样本的危害程度 同时应当谨慎地采取一些较为保守的标本处理方法 对于取自病人的标本 均应当遵循标准防护方法 并采用隔离防护措施 如手套 防护服 眼睛保护等 基础防护 处理此类标本时最低需要二级生物安全水平 标本的运送应当遵循国家和 或国际的规章和规定 在暴发病因不明的疾病时 应根据国家主管部门和 或WHO制订的专门指南 进行标