高效液相色谱与气相色谱的区别.ppt

2020 3 5 气相色谱GC和液相色谱HPLC区别 2013化验室内部培训 2 目录 气 液色谱法原理区别应用范围区别气相色谱和液相色谱优缺点仪器构造的区别小结 3 一 气 液色谱法原理区别 气相色谱法采用气体为流动相 载气 流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法 物质或其衍生物气化后 被载气带入色谱柱进行分离 各组分先后进入检测器 用记录仪 积分仪或数据处理系统记录色谱信号 高效液相色谱法用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂 缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱 经进样阀注入供试品 由流动相带入柱内 在柱内各成分被分离后 依次进入检测器 色谱信号由记录仪或积分仪记录 4 二 应用范围区别 1 气相 气相色谱法具有分离能力好 灵敏度高 分析速度快 操作方便等优点 但是受技术条件的限制 沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析 一般对500 以下不易挥发或受热易分解的物质部分可采用衍生化法或裂解法 2 液相 高效液相色谱法 只要求试样能制成溶液 而不需要气化 因此不受试样挥发性的限制 对于高沸点 热稳定性差 相对分子量大 大于400以上 的有机物 些物质几乎占有机物总数的75 80 原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离 分析 5 色谱常用术语 基线 当色谱柱中仅有流动相通过 没有组分进入检测器时 色谱仪记录的检测器响应信号曲线 色谱峰 当色谱柱流出组分进入检测器时 检测器响应信号随检测器中的组分浓度而改变的曲线 峰高 色谱峰顶点与基线之间的距离 峰面积 每个组分的色谱峰与基线之间所包围的面积 色谱峰的峰高峰面积是色谱定量分析的依据区域宽度 在色谱分离过程中 由于色谱柱内很难真正达到分配平衡 随着组分在柱内的迁移 组分的谱带宽度会增加 区域宽度用标准偏差 半峰宽和峰底宽三种参数来度量 6 保留值用于描述各组分色谱峰在色谱图中的位置或距离 是色谱定性分析的依据 死时间 不被固定相吸附或溶解的物质从进样开始到色谱图上出现峰极大值时所需的时间 保留时间 试样从进样开始到柱后出现待测组分峰极大值所需时间 调整保留时间 扣除死时间后某组分的保留时间 相对保留值 在一定实验条件下 组分i与另一组分s的调整保留值之比 它仅与柱温及固定相的性质有关 而与柱径 柱长 填充情况及流动相流速等无关 选择性因子 又称分离因子 指在一定条件下 在多元混合物中最难分离的物质对的调整保留值之比 7 分配系数K 在一定柱温下 组分在固定相与流动相之间的分配达到平衡时 组分在固定相与流动相中的浓度之比 K值越大则保留时间越长 一般因色谱柱中溶质浓度较低 K为常数 分配比k 又称容量因子 容量比 指组分在固定相和流动相中的分配量之比 8 三 气相色谱和液相色谱优缺点 GC的优点 分离效率高 对性质相似的烃类异构体 同位素分离能力强 能分析沸点十分接近的复杂混合物 灵敏度高 可检出10 11 10 13g的痕量物质 分析速度快试样用量少 气体1mL 液体1 L气体为流动相 阻力小 渗透强 分离效率高 价格相对较低 不易出故障 应用范围广 有机物 蒸汽压且稳定性好 易挥发 低沸点 450 以下 9 HPLC的优点 三高 一广 一快 高压 压力可达150 300Kg cm2 色谱柱每米降压为75Kg cm2以上 高灵敏度 紫外检测器灵敏度可达0 01ng 同时消耗样品少 高效 可达5000塔板每米 在一根柱中同时分离成份可达100种 应用范围广 70 有机物 尤其是高沸点 大分子 强极性 热稳定性差的化合物分离分析 分析速度快 载液流速快 通常分析一个样品在15 30min 有些在5min 一般小于1h 10 四 仪器构造的区别 气相色谱仪 由载气系统 进样系统 分离系统 检测系统 温控系统和记录系统组成 1 载气系统 载气系统实现载气管路的连续 密闭运行 在使用时必须控制载气的纯净 一般使用的载气纯度99 99 密闭 流速稳定及准确测量 常用载气有氮气 氢气 在使用FID时作燃气 氦气 氩气 载气系统主要组成部件 气体钢瓶 减压阀 净化管 气流调节阀 稳压阀 针形阀和温流阀 载气流量的测定 转子流量计 皂膜流量计 压力表 11 2 进样系统 进样系统主要由进样器和汽化室组成 进样器分液体进样器和气体样品进样器 液体进样器常用微量注射器 取样时要先用丙酮抽洗10次左右再用 取样后应立即进样 进样操作必须稳当 连贯迅速 使用后应立即清洗处理 气体样品进样器常用平面六通阀或拉杆六通阀 气相色谱仪的最高汽化温度一般为350 450 3 分离系统 柱箱 控制的温度在室温到450 填充柱 简单样品分离 内径2 4mm 柱长1 5m由不锈钢或玻璃管制成 毛细管柱 能完成复杂物质分离 内径0 1 0 5mm 柱长15 100m 由均匀的玻璃和石英管制成 12 4 检测系统 常用检测器性能特点和应用 13 问 TCD FID的性能特点 影响灵敏度因素及开关机顺序 幻灯片14幻灯片15幻灯片17FID系统在关机时为什么先关氢气再关电源 进样速度慢 对色谱峰有何影响 气相色谱柱老化的目的和方法 色谱柱老化的目的和方法 14 检测器的主要性能指标1 基线稳定 即噪声和漂移小 2 痕量的组分进入检测器时就有响应 即灵敏度高 检测限低 3 保持毛细管柱的高分离效能 即死体积小 4 快速分析 很窄的谱带快速通过快速通过检测器时 峰形不失真 即响应时间快 5 定量分析准确可靠 即线性范围宽 6 通用型检测器的适用范围广 选择型检测器的选择性好 TCD是浓度型检测器 对载气流速的波动很敏感 其峰面积响应值反比于载气流速 载气的纯度影响TCD的灵敏度 当桥电流和热丝温度一定 若降低池体温度 使池体和热丝的温差变大 利于热传导 以提高TCD的灵敏度 TCD的温度要高于柱温 防止试样组分在检测器内冷凝而造成污染 15 TCD使用注意事项 先开载气后开电 先关电后关载气 若没通气就开电源 热丝温度骤然升高 会烧坏热丝 开机时 应先通载气15min以上 保证气路空气赶走后 再通电 以防热丝被氧化 关机时 先断桥电流 让载气通一段时间 约30min 待TCD温度低于100 再关气源以延长热丝使用寿命 根据载气性质 桥电流不得超过允许值 用H2作载气桥电流控制在150 200mA 用N2作载气桥电流控制在100 200mA 更换汽化室硅胶垫时 务必先关热导池电源 换好后 需通几分钟载气 再开姐桥电流 仪器突然漏气 需先关热导池电源 再进行后续操作 TCD长期不使用 需将近气口和出气口堵塞 以防铼钨丝被氧化 样品保持纯净 避免样品或固定液流失损坏热丝 16 FID是一种结构简单 灵敏度高 死体积小 响应快 线性范围宽 稳定性好的选择型 破坏型和质量型检测器 使用非常广泛 氢气作为FID的燃气 其流速的大小影响检测器的灵敏度和稳定性 氢气流速过低 火焰温度低 组分离子化数目少 检测器灵敏度低 且易熄火 氢气流速过高 火焰不稳定 基线不稳 最佳氮氢流速比为 1 1 1 1 5 一般氢气与空气流量比为1 10 空气流速控制在300 500mL min 常量分析时 三种气体纯度在99 9 以上即可 痕量分析三种气体纯度在99 999 以上 空气总烃含量小于0 1uL L FID对温度变化不敏感 温度控制在80 200 为避免水蒸气和样品在检测器内冷凝 FID温度必须保持在120 以上 常用150 激化电压的大小会直接影响检测器的灵敏度 一般控制在150 300V 收集极应有较大的表面积 才能提高收集效率 17 FID的使用注意事项 先开载气 后开电源升温 氢气和空气在点火前开 先关氢气再关电源 最后关空气和载气 尽量使用高醇气源 并保证气路清洁 色谱柱必须进行老化处理 防止固定液流失引起噪声 开机时 必须先通载气 再升温 待检测器温度超过120 以上时才能通氢气点火 只有点多前才能打开氢气源 以免气体堆积产生危险和事故 关机时 必须先关氢气熄火 然后再关温度控制 当柱温降至室温时 再关载气和空气 否则 离子室容易积水而影响电极的绝缘 使基线不稳 FID应在最佳氮氢比和最佳空气流速条件下使用 当氢气比例过大 FID的灵敏度会急剧下降 若使用中其他条件不变 则要检查氢气和空气的流速 另外 在点火时 点燃就灭 再点随后又灭 即是氢气量不足 18 5 温控系统 温控系统是用于设定 控制和测量色谱柱箱 检测室和汽化室三处的温度 柱箱的温度一般为室温到400 箱内上下温差低于3 控制精度低于 0 1 除FID外 所有检测器对温度的变化都很敏感 尤其是热导检测器 温度的微小变化将会影响检测器的灵敏度和稳定性 所以检测室的控温精度应低于 0 1 6 记录系统 色谱数据处理机色谱工作站 19 色谱柱老化的目的和方法 老化目的 彻底除去固定相中的残留溶剂和某些易挥发性杂质 并促使固定液更加均匀 牢固地涂布在载体表面 老化方法 将色谱柱接入色谱仪气路中 柱的出气口 接真空泵一端 直接通大气 不要接检测器 以免柱中逸出的挥发物污染检测器 开启载气 一般用氮气 在稍高于操作柱温下 老化温度一般为实际操作温度以上30 注意不要超过固定液的最高使用温度 以较低流速 通常为正常流速的一半 连续通入载气一段时间 老化时间取决于载体和固定液的种类及质量 一般为8 20h 老化完成后 将仪器温度降至近室温 关闭色谱仪 待仪器温度降至室温后 再将色谱柱出口端接至检测器上 开机 在使用温度下观察基线是否平稳 若基线平稳 说明柱的老化已完成 可进样分析 否则继续老化 20 高效液相色谱仪由高压输液泵 进样器 色谱柱 检测器和工作站五部分组成 1 高压输液泵 输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性 高压输液泵必须具备流量准确可调 耐高压 液流稳定 泵的死体积小 输液泵的流量稳定直接影响到保留值 因此常用恒流泵 2 进样器 进样分手动和自动两种方式 一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作 进样量是恒定的 这对提高分析样品的重复性是有益的 进样器要求密封性好 死体积小 重复性好 进样时引起色谱系统的压力和流量波动很小 21 3 色谱柱 色谱柱是实现分离的核心部件 要求柱效高 柱容量大和性能稳定 柱性能和柱结构 填料特性 填充质量和使用条件有关 色谱柱一般长度为10 50cm 内径为2 5mm 由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成 4 检测器 检测器是用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置 是利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理 紫外 可见光检测器基于郎伯 比耳定律 很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团 有较强的紫外或可见光吸收能力 具较高的灵敏度 有广泛的应用范围 22 示差折光检测器 RI 基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异 当组分洗脱出来 会引起流动相折射率的变化 这种变化与样品组分的浓度成正比 RI是一种通用的检测方法 荧光检测器基于组分 如多环芳烃 氨基酸 胺类 维生素和某些蛋白质等 被紫外光照射后 发射出较激发光波长要长的荧光 荧光强度与激发光强度 量子效率和样品浓度成正比 其具有非常高的灵敏度和良好的选择性 适合药物和生物化学样品的分析 5 工作站 可对分析全过程 分析条件 仪器状态 分析状态 进行在线显示 自动采集 处理和储存分析数据 23 液相色谱固定相和流动相 在色谱分析中 如何选择最佳的色谱条件实现最理想的分离 1 选用合适的基质 载体 硅胶 是HPLC填料中最普遍的基质 广泛适用于极性和非极性溶剂 但在碱性水溶性流动相中不稳定 常规分析pH范围为2 8 氧化铝 具有与硅胶相同的良好物理性质 也能耐较大的pH范围 它也是刚性的 不会在溶剂中收缩或膨胀 但氧化铝键合相在水性流动相中不稳定 聚合物 以高交联度的苯乙烯 二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的HPLC 它们的压力限度比无机填料低 广泛用于分离大分子物质 24 2 化学键合固定相 目前 化学键合相广泛采用微粒多孔硅胶为基质 用烷烃二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷与硅胶表面游离的硅醇基反应 形成Si O Si C键形的单分子膜而制得 常用的极性键合相主要有氰基 CN 氨基 NH2 和二醇基 DIOL 键合相 常用于正向色谱 常用的非极性键合相主要有各种烷基 C1 C18 和苯基 苯甲基等 以C18应用最广 另外C18柱稳定性较高 但C18基团空间体积较大 使有效孔径变小 分离大分子化合物时柱效较低 固定相的选择 分离中等极性和极性较强的化合物可以选择极性键合相 分离非极性和极性较弱的化合物可以选择非极性键合相 25 3 流动相流动相的性质要求 流动相不应改变填料的任何性质 纯度 分析纯以上 必须与检测器匹配 黏度要低 对样品的溶解度要适宜 样品易于回收 流动相选择 在正相色谱中 溶剂的强度随极性的增强而增加 在反相色谱中 溶剂的强度随极性的增强而减弱 正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂 反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂 再加入一定量的能与水互溶的极性调节剂 如甲醇和四氢呋喃等 26 流动相的pH 对于弱酸 流动相的pH越小 组分的分配比k值越大 当pH远远小于弱酸pKa值时 弱酸主要以分子形式存在 对于弱碱 情况相反 分析若酸样品时 通常在流动相中加入少量弱酸 常用50mmol L磷酸盐缓冲溶液和1 醋酸溶