3.细胞融合及单克隆抗体的制备.ppt

细胞融合单克隆抗体制备技术 1 细胞融合 CellFusion 细胞融合 即两个或两个以上细胞合并成一个细胞的过程 即将两个离体细胞在特殊融合剂的作用下 细胞膜发生一定变化 使两个或多个细胞发生融合 形成体细胞杂交 SomaticHybridization 产生一个新的杂种细胞 Hybrid 细胞融合是正常的生命活动 两个细胞正在融合 受精作用 Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞 Virchow于1858年描述了正常组织 发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物 蛙类 的血液细胞发生融合的过程 Cienkawski 1876 Buck 1877 Geddes 1880 在无脊椎动中发现了细胞合并现象 1958年日本学者冈田 Okada 发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇 PEG 化学融合法 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞 20世纪80年代出现了电融合技术 细胞融合研究进展 显微镜下细胞融合过程 融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解 细胞融合剂 病毒类化合物生物制剂 DNA病毒 水痘病毒 疱疹病毒 天花病毒RNA病毒 仙台病毒 腮腺炎病毒 麻疹病毒 肉瘤病毒冠状病毒 禽类感染性气管炎病毒 脂溶性 PEG DMSO ConA水溶性 溶血卵磷脂 磷脂酰丝氨酸 昆虫提取物 细胞融合的常用方法 仙台病毒法聚乙二醇 PEG 法电融合法 仙台病毒法 仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段 两种细胞在一起培养 加入病毒 在4 条件下病毒附着在细胞膜上 并使两细胞相互凝聚 在37 中 病毒与细胞膜发生反应 细胞膜受到破坏 此时需要Ca2 和Mg2 最适PH为8 0一8 2 细胞膜连接部穿通 周边连接部修复 此时需Ca2 和ATP 融合成巨大细胞 仍需ATP 病毒促使细胞融合的主要步骤如下 1 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近 2 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透 胞质互相渗透 3 两个原生质体的细胞核互相融合 两个细胞融为一体 4 进入正常的细胞分裂途径 分裂成含有两种染色体的杂种细胞 优点是易得 用法简单 融合效果稳定 聚乙二醇 PEG 分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂 PEG浓度以W W 如将10克PEG与10mlEagLe氏液混合 假定1ml培养液为1g重 即成50 PEG溶液 PEG经高压灭菌后 与温热的Engle氏液混合 通常用分子量低于1000的PEG作融合剂最好 50 PEG溶液能产生最多杂交细胞 PEG溶液在pH6 0时细胞融合率最高 聚乙二醇 PEG 法 PEG诱导融合的特点 其优点是融合成本低 勿需特殊设备 融合子产生的异核率较高 融合过程不受物种限制 其缺点是融合过程繁琐 PEG可能对细胞有毒害 PEG的作用机理 Kao等认为 由于PEG分子具有轻微的负极性 故可以与具有正极性基团的水 蛋白质和碳水化合物等形成H键 从而在在质膜之间形成分子桥 其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合 另外 PEG能增加类脂膜的流动性 也使细胞的核 细胞器发生融合成为可能 聚乙二醇 PEG 法细胞融合过程 聚乙二醇 PEG 法细胞融合步骤 1 将两种不同亲本细胞各5 l06混匀 2 离心沉淀 吸去上清液 3 加1ml50 PEG溶液 用吸管吹打 使之与细胞接触1分钟 4 加9ml培养液 离心沉淀 吸去上清液 5 加5ml培养液 分别接种5个直径60mm平皿 每个平皿加培养液至5ml 37 的CO2培养箱中培养 6 6 24小时后 换成选择培养液筛选杂交细胞 电融合法 电融合法是80年代出现的细胞融合技术 在直流电脉冲的诱导下 细胞膜表面的氧化还原电位发生改变 使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂 进而质膜开始连接 直到闭和成完整的膜 形成融合体 电融合法的优点 融合率高 重复性强 对细胞伤害小 装置精巧 方法简单 可在显微镜下观察或录像观察融合过程 免去PEG诱导后的洗涤过程 诱导过程可控性强 电融合的基本过程 细胞膜的接触 当原生质体置于电导率很低的溶液中时 电场通电后 电流即通过原生质体而不是通过溶液 其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子 从而使原生质体紧密接触排列成串 膜的击穿 原生质体成串排列后 立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿 从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起 电融合诱导法原理示意图 细胞融合的意义 理论上说任何细胞 都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源 这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制 为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统 在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体 线粒体DNA亦可发生重组 从而产生新的核外遗传系统 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备 2 单克隆抗体技术 过敏食物动物植物花粉昆虫 污染移植药物輸血细菌病毒 抗体是一种蛋白质 抗体由四条蛋白质长短链组成 两长两短 抗体分子上有两个抗原结合区 二者相同 抗体与抗原结合是专一性的 lock key Epitope Antigenicdeterminant抗原决定簇 一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇每个抗原决定簇至少诱生一种专一性抗体蛋白质性抗原决定簇含有六个以上氨基酸 一个B细胞只能产生一种抗体 对付某一抗原决定簇 若有许多抗原决定簇 则需许多B细胞分别产生抗体 多克隆抗体混合抗体 单克隆抗体各抗体分开 多克隆抗体 Polyclonalantibody PcAb 针对多种抗原决定簇的混合抗体单克隆抗体 Monoclonalantibody McAb 由单个B细胞克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体 接受抗原刺激后 能分泌针对该抗原的特异性抗体 在体液免疫中具有重要功能 B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞 通常不再进行细胞分裂 存活一段时间后便会死亡 短命细胞 单克隆抗体制备的3个技术要点 1 B淋巴细胞与骨髓瘤细胞的特性 B淋巴细胞 Blymphocytes 骨髓瘤细胞 myelomacells 恶性增殖的转化细胞 只要营养条件适合可永远分裂和存活 长命细胞 经筛选与驯化 现已建立多种骨髓瘤细胞株 没有抗体分泌物 2 细胞融合技术 长命不分泌抗体 分泌抗体短命 分泌抗体长命 K hler和Milstein 1975 1984年Nobel医学奖 3 杂交瘤细胞的筛选 杂交瘤细胞 B B M M M B 筛选出 不能长期存活 不能长期存活 HAT培养基筛选 H 次黄嘌呤 A 氨基喋呤 T 胸腺嘧啶 DNA 谷氨酰胺or单磷酸尿苷酸 A Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 HGPRT 胸腺嘧啶激酶 TK Thymidinekinase B淋巴细胞 HGPRT TK 骨髓瘤细胞 HGPRT TK 存活 死亡 外源性途径 旁路途径 内源性途径 主要途径 单克隆抗体技术操作流程 1 动物免疫 目的 在细胞融合后获得尽可能多的分泌针对于该目标抗原的特异性抗体的杂交瘤细胞 特定目标抗原 动物 免疫 脾脏中B淋巴细胞 B淋巴细胞大量增殖 刺激 能分泌针对于该抗原的特异性抗体 常规免疫法脾内一次性免疫法短程免疫法体外免疫法 常用免疫方法 稳妥 优势克隆 省时 省抗原 省时 操作繁琐 常规免疫法 加佐剂制成乳剂 试采血 皮下注射 皮下注射 静脉注射 2 细胞悬液的制备与融合 脾细胞悬液的制备 最后一次免疫后第3天制备 2 骨髓瘤细胞悬液的制备 于对数生长期制备 3 细胞融合 50 PEG 400 1000 pH8 0 37oC 2min 3 融合细胞的筛选 4 抗体的检测 要求 简便 快速 敏感 在短时间内能检测大量样品 常用方法 酶联免疫吸附法 enzyme linkedimmunosorbentassay ELISA 被动血凝法细胞毒实验Western杂交法 westernblot 间接免疫荧光法 Indirectimmunofluorescence IFA 放射免疫法 radioimmunoassay RIA 酶联免疫吸附法 ELISA 技术原理 改进后的方法 在适当稀释的杂交瘤阳性克隆上清中加上过量抗原 再用上述致敏的红细胞 指示细胞 进行检测 则为血凝抑制 改进后的血凝抑制试验是种检测抗体特异性的简单有效的方法 被动血凝法 原理 将特异性抗原通过化学偶联法结合在红细胞表面作为指示细胞 当与相应特异抗体结合 即可导致红细胞凝聚 原理 当鼠McAb与靶细胞表面抗原结合形成膜Ag Ab复合物后 加入适量补体 在补体介导下 使细胞破坏 打孔 以致细胞破裂死亡 细胞毒实验 染料着色法在显微镜下计数着染的死细胞51Cr释放试验测量细胞51Cr量MTT法测定细胞琥珀酸脱氢酶活性 Western杂交法 5 单克隆化 常用克隆化方法 有限稀释法软琼脂平板法显微操作法 80个细胞 96孔饲养细胞 feedercells ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清 选出分泌特异性抗体的阳性孔 所分泌抗体即为单克隆抗体 有限稀释法 A B C D E F G H 调细胞浓度为1 5 103cell ml取100个cell于7 2ml完全培养液 M 中 150ul 孔 150ul 孔 150ul 孔 3 6mlM 3 6mlM 2个cell 孔 1个cell 孔 0 5个cell 孔 6 杂交瘤细胞的鉴定 染色体核型分析 大规模培养 批量生产单克隆抗体 常用的大规模培养方法 动物接种法转瓶培养法细胞培养罐法 小鼠腹腔注射降植丸或液体石蜡 1周后腹腔注射杂交瘤细胞 7 10天后出现腹水 无菌采集 单抗纯化方法 盐析凝胶过滤离子交换层析亲和层析法辛酸沉淀法 用中性盐使蛋白质沉淀析出的方法为盐析 大量的盐加入到蛋白溶液中 高浓度的盐离子有很强的水化力 可夺取蛋白质的水化层 使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出 血清50 饱和度硫酸铵上清 白蛋白 沉淀 球蛋白 33 饱和度硫酸胺上清沉淀拟球蛋白r球蛋白 盐析 凝胶过滤 干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒 将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时 大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内 留在胶粒间隙的溶液中 随洗脱液最先流出 小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内 受到凝胶的阻留 向下移动较慢洗脱出来较慢 据此将不同大小的蛋白质分离出来 交联葡聚糖凝胶 Sephadex 琼脂糖凝胶 Sepharose 离子交换层析法 DEAE纤维素 结合溶液中带负电荷的蛋白质 又称阴离子交换剂CM纤维素 结合溶液中带正电荷的蛋白质 又称阳离子交换剂 X Z Z X X X Y Z Y Z X OH nX 平衡上样 吸附 洗杂 洗脱 亲和层析法 将抗原连接到固相载体上 特异性吸附液相中的抗体 形成抗原抗体复合物 然后改变条件 使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体 洗脱液 支持物 被分离物质 被分离物质的抗体 其它物质 L S L L S S S 杂质 S S L L L L L 配基 样品 配基固定化 吸附样品 样品洗脱 辛酸沉淀法 腹水 辛酸 短链脂肪酸酸性条件下可沉淀水中的白蛋白及其他非IgG蛋白 沉淀 上清 饱和硫酸铵 沉淀IgG PBS溶解 透析 举例 抗HLA G单克隆抗体的研制及其初步鉴定 属于非经典HLA I分子具有有限的多态性组织分布的局限性 抑制NK细胞的杀伤活性抑制T细胞增殖可能抑制CTL杀伤活性 HLA G HLA G的生物学功能 技术路线 免疫原制备 免疫动物 细胞融合 SP2 0的准备 选择培养 筛选 克隆化 效价检测 鉴定 得到HLA G特异性单抗杂交瘤 抗原的选择 方法与结果 美联 西安 生命科技有限公司合成24肽 EEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGC COOH MW 2802 1区第61 83 85 107 位氨基酸羧基端接一个Cys构成的24肽纯度要求95 以上 一 抗原肽的合成 纯化 抗原肽的纯化结果 95 086 二 抗原肽与载体蛋白偶联 纯化 mcKLH mcKLH mcKLH Peptide mcKLH mcKLH mcKLH 三 免疫BALB c小鼠 含100ug抗原 含100ug抗原 用peptide BSA 四 融合 效价最高的小鼠冲击免疫3天后取脾细胞 取预先准备好的SP2 0细胞产生的实体瘤 分离细胞 SP2 0 免疫小鼠脾细胞 PEG诱导的细胞融合 接种于HAT选择培养液 饲养细胞 五 选择培养 筛选和克化隆 ELISA抗原特异性筛选