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常见肿瘤基因检测规范及进展：肺癌EGFR2013/12/29医脉通分享：导读肺癌患者在应用靶向治疗前进行EGFR基因突变检测具有重要临床意义，而检测结果的准确性也将直接影响患者靶向治疗选择和疗效。本文就肺癌EGFR基因突变的分子病理学检测中主要的质量控制和质量保证要点进行介绍。目前，吉非替尼和厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI）已被证明是治疗晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的有效靶向药物，并只对表皮生长因子受体（EGFR）基因敏感突变类型的肺癌患者才显示很好疗效，肺癌患者在应用EGFR-TKI靶向治疗前进行EGFR基因突变检测具有重要临床意义，而检测结果的准确性也将直接影响患者靶向治疗选择和疗效。本文就肺癌EGFR基因突变的分子病理学检测中主要的质量控制和质量保证要点进行介绍。1、检测实验室及人员要求常规EGFR突变检测方法基于基因扩增技术之上，其检测应严格在基因扩增实验室进行，实验室包括试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增区和产物分析区等4个区。因肺癌EGFR检测的标本多为石蜡包埋的组织蜡块，实验室应设置独立的标本制备预处理区（切片区），严防标本在制片过程中被污染。各工作分区应标识清晰，仪器设备应满足检测要求，各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等不可混用。检测过程中严格质量控制，实验完毕后做好清洁消毒工作。分子病理学聚合酶链式反应（PCR）实验室工作人员应参加我国卫生和计划生育委员会指定的机构举办的技术培训后取得合格证，并定期进行培训。2、EGFR突变检测的标本要求需要进行EGFR-TKI靶向治疗的患者应进行EGFR基因突变筛选；临床标准（女性，无吸烟史等）不能决定是否进行检测；有研究表明，免疫组织化学染色（IHC）检出总EGFR蛋白表达也不推荐TKI治疗筛选。EGFR突变检测，对肺癌部分切除标本建议用于腺癌和含腺癌成分的混合型肺癌，不考虑组织学分级；对肺癌全切标本，不建议用于无任何腺癌成分的肺癌，例如纯鳞癌、纯小细胞癌或IHC未显示腺癌分化的大细胞癌；对小标本（活检、细胞学标本），如果不能完全除外腺癌，可检测组织学表现为鳞癌或小细胞癌的标本检测，但应结合临床标准（年轻患者、无吸烟史）协助筛选；对初治患者，检测原发灶或转移灶；对于多发性原发肺腺癌，可分别检测，但不必对同一肿瘤多个区域检测。在确定EGFR-TKI治疗的进展期（期）肺癌患者，或低期别患者发生复发或进展（原先未进行检测）时，应行EGFR突变检测。由于肺癌复发转移率高，对期肺癌，在诊断时鼓励患者进行检测，以便出现复发时及时治疗，但应视具体情况决定。3、EGFR突变检测流程标本处理手术或活检组织标本应在离体30分钟内用10%中性福尔马林固定，避免用酸性、重金属固定液或脱钙液等处理；活检小标本固定624小时，手术切除大标本固定848小时；细胞学标本可用于EGFR突变检测，细胞石蜡包埋块优于细胞涂片。标本评估及DNA提取对检测标本进行病理形态学评估是EGFR检测最重要的质量控制之一，病理医生首先应评估整个样本中肿瘤细胞含量（肿瘤细胞百分比），确定标本是否满足检测要求（所采用检测方法的敏感性），必要时进行微切割富集肿瘤，EGFR突变检测标本使用的切片机刀架座须清洁并消毒，不同标本切片时要更换刀片；制备310张厚8m组织切片，对照HE染色结果刮取肿瘤细胞丰富区域，避开非肿瘤区和坏死区等；采用标准试剂盒提取基因组DNA，并测定DNA浓度。EGFR突变检测EGFR突变检测方法有很多种，应结合检测标本特点来判断是否进行检测。最传统的直接测序法（Sanger测序）可得到序列的直接信息，对未知突变的检出具有优势，是直接有效地检测基因突变状态的方法，但敏感性较低，实验操作时间长、步骤复杂、易污染。以实时定量PCR（RT-PCR）为平台的突变检测技术，均须根据已知的突变类型设计引物和探针，因此无法检测出所有可能的突变，但敏感性较直接测序法高，操作简单，不必对PCR产物进行操作，很大程度避免了扩增产物的污染。实验室应采用能在至少含50%肿瘤细胞的标本中检测到突变的方法。推荐采用更敏感的方法，至少能在含10%肿瘤细胞的标本中检测到突变，但不可一味追求高敏感性，而忽视对特异性和准确性的考量。另外，不同实验条件、不同样本中检测的最适方法也可能不同，应根据实际情况选择适合的EGFR基因突变检测方法，通过预实验验证所采用方法的准确性和敏感性，无论采用何种检测方法，临床EGFR基因突变检测应能检测所有突变频率在1%以上的突变类型。EGFR突变检测结果分析与报告EGFR突变检测根据各自检测方法的判读标准分析检测结果。测序法检测EGFR基因突变，成功的峰形图的峰形规则，如图1，RT-PCR法检测EGFR基因突变结果如图2所示；如果检测结果可疑（图3，4），应重复进行检测或采用其他的检测方法验证。EGFR突变检测报告须包括结果和说明，报告内容应让肿瘤医生和其他病理医生易于理解，检测实验室收到标本后2周（10个工作日）内签发报告，平均检测周期2周的实验室应有措施（自身或第3方实验室）来保证紧急病例能更快得到检测结果。4、EGFR突变检测的其他质量控制与质量保证分子检测实验室人员应严格按照已经验证的标准化操作流程进行EGFR检测，EGFR突变检测验证应与其他分子诊断相同，每次实验设置阴性和阳性质控，定期总结检测结果，及时发现并解决问题。实验室