4单倍体细胞培养.ppt

4单倍体细胞培养 单倍体细胞培养包括三个方面 花药培养 小孢子培养 未受精子房及卵细胞培养 根据物种倍性不同 单倍体可以分为两大类 一类是一倍单倍体 即二倍体物种产生的单倍体 另一类是多倍单倍体 即起源于多倍体物种 如4x 6x 花药培养是指未成熟的花药接种在人工培养基上分化为植株的过程 由于这种分化植株起源于花药中的未成熟的花粉 所以 人们常将花药培养和花粉培养相提并论 花药和花粉分属于不同的范畴 即花药是一个植株体上的器官 属于器官培养 而花粉则在一般意义上 是一个单细胞 应该属于细胞培养的范畴 植物界 在棉 水稻 咖啡 甜菜 大麦 大麻 可可 油菜 西红柿 芦笋和小麦等作物中 都发现过自发产生的单倍体 某些低等的生物 如酵母 霉菌和苔藓等 以单倍体为主要的生活世代 被子植物的花药中 细胞按染色体的倍性可分为两类 一类为单倍体细胞 即由花粉中的花粉母细胞减数分裂后形成的小孢子 另一类为二倍体细胞 如药隔 药壁及花丝等组织 4 1花药培养 花药是花的雄性器官 花药培养属器官培养 我国花药培养工作虽然开始较晚 但在短短的时间内取得了可喜的进展 1974年中国农科院植物研究所和中国农业科学院烟草研究所 仅仅用了三年的时间 就培养出世界上第一个作物新品种 单育1号烟草品种 花药离体培养的方法是通过花粉粒直接培养出单倍体植株 花药离体培养法具有技术简单 诱导容易和诱导频率高等优点 许多栽培物种都用这种方法获得了单倍体 子房培养是20世纪70年代发展起来的一门新技术 已经在小麦 玉米 水稻 青稞 大卫百合 烟草等植物中获得了成功 单倍体植株不存在显隐性的问题 一旦发生突变 即可以表达 理想的诱变方法是利用化学药物或者辐射处理 对于单倍体细胞的培养物 包括愈伤组织 原生质体 小孢子等 将其进行诱变 可以使植物育种微生物化 在过去的10多年的研究中 已经取得了令人满意的结果 花药培养的意义1 同常规的育种方法相比 利用花药培养可以大大缩短育种年限 2 利用花药培养的单倍体育种较常规育种便于根据表现型进行选择 3 单倍体加倍的纯度 较常规的自交选育出来的自交系纯度要高的多 4 对于自交不亲和的物种可以获得杂交种子 5 在远源杂交方面具有较大的利用价值 花药培养的基本程序包括 挑选适宜的基因型作材料 确定花粉发育时期 材料的预处理 诱导培养 分化培养 染色体数观察和染色体数加倍 花粉植株当代及后代观察鉴定 影响花药培养的因素很多 如材料生理状况和基因型 接种时期 接种方式 如直插 或平放 培养方式 固体 漂浮 液体浅层连续培养 条件培养等 基本培养基种类 激素 密度效应与条件培养等 4 2花粉培养 花粉培养 把花粉从花药中分离出来 以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术 由于花粉已是单倍体细胞 诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株 且不受花药的药隔 药壁 花丝等体细胞的干扰 但缺点是比花粉培养难度大 4 2 1材料的准备 1 材料消毒基本方法 取新鲜未开的花蕾用自来水冲洗10分钟 用75 的酒精消毒10 15分钟 无菌水冲洗2次 再用10 漂白粉上清液浸泡20分钟 无菌水冲洗3 4次 然后将花药放到加有基本培养基的小烧杯中 用注射器的内管在烧杯的壁上挤压花药 使花粉从花药中释放出来 用尼龙筛过滤掉药壁组织 滤液再经低速离心 100 160r min 上面的碎片可用吸管吸掉 再加入新鲜培养基 连续进行两次过滤 到每毫升含103 104个花粉的浓度即可 2 选用适宜发育时期的花粉花药培养成功的关键因素之一是花粉发育时期要合适 一般以单核晚期为宜 有的植物所需时期可能略早或略晚些 首先要确定合适花蕾的标准 在烟草中一般以花冠与萼片等长为准 也可通过观察花粉进一步确定 为此 取大小不同的幼嫩花蕾 从中取出花药 置于载玻片上 加一滴醋酸洋红染液 挤压出花粉 染色后在显微镜下观察 以花粉的单核靠边为准选取花蕾 3 逆境处理对小孢子脱分化和再分化的影响 温度处理效应 高糖预处理效应 由花粉发育成的单倍体植株只有配子一组染色体 是不能结实的 因而需要将染色体加倍成二倍体 组织培养中 可能自然加倍 但其频率低 常用的染色体加倍的办法是用秋水仙碱溶液浸泡小苗 当小苗移入Nitsch培养基前 于无菌条件下 将0 2 0 4 的秋水仙碱溶液倒入培养瓶中 一般处理24 48小时 倒去秋水仙碱液 用无菌水洗3次后 再将小苗移至Nitsch培养基中继续培养 可能得到一些染色体加倍的再生苗 对于了解再生植株染色体是否加倍成功 可从形态上加以鉴别 单倍体植株株型矮小 叶片 气孔 花粉粒都小些 不能结实 但最可靠的办法还是制作染色体玻片标本 检查染色体数目 4 2 2诱导小孢子脱分化和再分化的措施1 掌握小孢子脱分化和再分化所需的时间2 诱导小孢子形成胚状体和愈伤组织 选取合适的基本培养基配方 糖种类和糖浓度合适 植物激素的选用 4 2 3分化培养和壮苗培养所需条件1 选择合适基本培养基2 进行植物激素的调节3 糖浓度的调节 4 2 4完整植株的形成4 2 5再生小植株的驯化和移植 4 3单倍体植株的鉴定和二倍化方法 4 3 1花粉单倍体植株鉴定的理由1 体细胞干扰2 生殖细胞的自发加倍 4 3 2花粉植株的鉴定方法1 形态鉴定2 细胞学鉴定3 杂交法鉴定4 分子标记鉴定 花粉粒着色鉴定原理 凡有活力的种胚在呼吸作用过程中都有氧化还原反应 而无活力的种胚则无此反应 当TTC 2 3 5 氯化或溴化三苯基四氮唑简称四唑 溶液渗入种胚的活细胞内 并作为氢受体被脱氢辅酶上的氢还原时 便由无色的TTC变为红色的三苯基甲 TTF 从而使种胚着色 当种胚生活力下降时 呼吸作用明显减弱 脱氢酶的活性亦大大下降 胚的颜色变化不明显 故可由染色的程度推知种子生活力强弱 4 3 3单倍体植株的染色体加倍方法1 小苗浸泡法2 生长锥处理3 培养基加倍 4 4单倍体细胞培养的应用 5细胞培养 5 1前言使用单细胞系统比使用完整的器官或植株有更大的优越性 使用游离细胞系统时 可以让各种化学药品和放射性物质很快作用于细胞 又能很快停止作用 通过单细胞克隆 可以将微生物的遗传学技术应用于高等植物的作物改良 5 2单细胞的分离 5 2 1由完整的植物器官分离单细胞1 机械法将植物叶片放入研钵中 加入研磨介质轻轻研磨 匀浆用纱布过滤 在研磨介质中低速离心 分离出具光合活性和呼吸活性的叶肉细胞 和酶解法相比 机械法具有的优点 细胞不会受到酶的伤害 无须质壁分离 2 酶解法优点 有可能得到海绵薄壁细胞或栅栏薄壁细胞的纯材料 5 2 2由愈伤组织中分离单细胞 方法 将易散碎未分化的愈伤组织转入液体培养基中 常温 弱光 或黑暗 下震荡培养 继代 淘汰细胞碎片 得到单细胞或小细胞团 震荡培养中震荡的作用 对细胞团施加缓和压力 使其破碎成小细胞团和单细胞 使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀分布 促进培养基和容器内空气之间的气体交换 为了获得充分分散的细胞悬浮液 应尽可能使用易散碎的愈伤组织 将愈伤组织在半固体培养基上保存2 3个继代周期 增加其松散性 在分批培养中 细胞数目增长的变化情况表现为一条S形曲线 如下图 对于单细胞 低密度悬浮细胞 或过于细小的细胞团 不宜直接转到半固体培养基上培养 先进行液体浅层培养或看护培养 待形成较大细胞团后 再转到半固体培养基上诱导愈伤组织 5 3单细胞培养 5 3 1单细胞培养方法1 平板培养法该培养法为最常用的单细胞培养方法 2 看护培养法 特点 把单个细胞置于一块活跃生长的愈伤组织上培养 在愈伤组织和培养的细胞之间 用一块滤纸隔开 3微室培养法 特点 在培养过程中可以连续进行显微观察 把细胞的生长 分