2016上课基因工程一轮复习.ppt

选修三现代生物科技专题 专题1 基因工程 一 基因工程的概念 指按照人们的愿望 进行严格的设计 并通过体外DNA重组和转基因等技术 赋予生物以新的遗传特性 从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的 因此又叫做DNA重组技术 基因工程 基因拼接技术 DNA重组技术 1 供体 提供 2 操作环境 3 操作水平 水平 4 原理 5 受体 表达目的基因 6 本质 性状在 体内表达 7 优点 克服 障碍 定向改造生物 目的基因 体外 分子 基因重组 受体 远缘杂交不亲和 性状 记一记 对基因工程的概念的理解 1 基因拼接的理论基础 从结构上分析 为什么不同生物的DNA能够重组 1 大多数生物的遗传物质是DNA 2 DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸 3 双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 一 基因工程诞生的理论基础 2 外源基因在受体内表达的理论基础 1 基因是控制生物性状的独立遗传单位 2 遗传信息的传递都遵循中心法则 3 生物界共用一套遗传密码 DNA重组技术的基本工具 工欲善其事 必先利其器 想一想 获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢 实现这一精确的操作过程的工具是什么呢 1 1DNA重组技术的基本工具 限制性核酸内切酶 分子手术刀 DNA连接酶 分子缝合针 运载体 分子运输车 识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列 并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 6个 4 5 8个 主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶 4000种 1 来源 2 种类 3 作用 4 结果 形成两种末端 1 限制性核酸内切酶 分子手术刀 小结 记一记 要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切点 可产生几个黏性末端 一个目的基因有几个黏性末端 要切两个切点 产生四个黏性末端 两个 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割 会怎样呢 会产生相同的黏性末端 是不是把两者的黏性末端黏合起来 这样就真的合成重组的DNA分子了 实际还不够 还需要DNA连接酶进行连接 思考题 限制酶存在于原核生物中的作用是什么 思考 原核生物容易受到外源DNA的入侵限制酶的作用 切割外源DNA 使之失效保证自身的安全 限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA 思考 防御机制 1 同一原核细胞内有限制酶 但没切割序列 2 有酶且有切割序列 但甲基化酶的作用下把甲基转移到碱基上 让限制酶不能切割 2 分子缝合针 DNA连接酶 2 分类 E coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 想一想 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗 1 来源 2 作用 1 来源 2 作用 1 作用 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 大肠杆菌 缝合 黏性末端 T4噬菌体 缝合 黏性末端和平末端 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗 为什么 只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上 形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键 都是蛋白质 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 以一条DNA链为模板 将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链 不需要模板 将DNA双链上的两个缺口同时连接起来 以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段 试分析 GC AATTC GC CTTAACG G CG G 1 其中 和是由一种限制酶切割形成的末端 两者要重组成一个DNA分子 所用DNA连接酶通常是 2 和是由另一种限制酶切割形成的末端 两者要形成重组DNA片段 所用的连接酶通常是 反馈练习 B 3 基因的运输工具 运载体 质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中 是细菌拟核DNA之外能够自主复制的很小的双链环状DNA分子 常用的运载体 质粒 噬菌体的衍生物和动植物病毒等 作为载体的必要条件 1 能自我复制或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 2 有一或多个限制酶的切割位点 3 必须带有标记基因 供重组DNA的鉴定和选择4 对受体细胞无毒害5 大小应合适 便于提取和体外操作 记一记 载体的作用 相当于一种运输工具 将外源基因转移到受体细胞中去 四个主要步骤 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 1 2基因工程的基本操作程序 一 目的基因的获取 1 目的基因主要是指 也可以是一些具有调控作用的因子 编码蛋白质的结构基因 3 常用方法 人工合成法 反转录法 化学合成法 利用PCR技术扩增 从基因文库中获取 2 获得途径 从自然界已有物种中分离 人工方法合成 基因文库 1 从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断 导入到受体菌的群体中 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因 称为基因文库 cDNA文库的构建模式图 杂交双链 单链RNA 单链DNA 单链DNA 双链DNA cDNA 与载体连接后导入受体菌贮存 组成cDNA文库 基因组文库与cDNA文库的比较P10表 小 大 有 无 有 无 某种生物的全部基因 某种生物的部分基因 部分基因可以 可以 2 利用PCR技术扩增目的基因 1 定义 PCR 多聚酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 通过此技术 可获取大量的目的基因 DNA复制 2 原理 3 条件 4 过程 5 方式 一段已知目的基因的核苷酸序列 模板DNA DNA引物 四种脱氧核苷酸 热稳定DNA聚合酶 Taq酶 能量 以 方式扩增 即 n为扩增循环的次数 指数 2n 6 仪器 PCR扩增仪 PCR技术扩增与DNA复制的比较 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板 能量 酶 高温下变性解旋 解旋酶催化 体外复制 PCR扩增仪内 主要在细胞核内 热稳定的DNA聚合酶 Taq酶 大量的DNA片段 形成整个DNA分子 解旋酶 普通的DNA聚合酶等 3 人工合成 反转录法 目的基因的mRNA 杂交双链 单链RNA 单链DNA 单链DNA 反转录酶 DNA聚合酶 双链DNA 目的基因 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 基因的脱氧核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 二 基因表达载体的构建 核心 1 用一定的 切割质粒 使其出现一个切口 露出 2 用 切断目的基因 使其产生 3 将切下的目的基因片段插入质粒的 处 再加入适量 形成了一个重组DNA分子 重组质粒 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 相同的黏性末端 切口 DNA连接酶 1 过程 同一种限制酶 目的基因与运载体结合 3 基因表达载体的组成 a 目的基因 b 启动子 c 终止子 d 标记基因 位于基因的首端 是mRNA识别并结合位点 位于基因的末端 终止转录 检测受体细胞中是否有目的基因 从而将含有目的基因的细胞筛选出来 2 基因表达载体的作用 a 使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b 同时使目的基因能表达和发挥作用 三 将目的基因导入受体细胞 目的基因进入 内 并且在受体细胞内维持 和 的过程 转化 受体细胞 稳定 表达 1 导入植物细胞 2 导入动物细胞 3 导入微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞法 或Ca2 转化法 1 将目的基因导入植物细胞 1 农杆菌转化法 特点 能感染双子叶植物和祼子植物 对单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上 转化过程 Ti质粒目的基因 构建 表达载体 植物细胞 植物细胞染色DNA 新性状 农杆菌 两次拼接 两次导入 2 基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法 是利用压缩气体产生的动力 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中 使目的基因与其整合并表达的方法 适用于单子叶植物 3 花粉通道法 花粉管通道法就是在植物受粉后 花粉形成的花粉管还未愈合前 剪去柱头 然后 滴加DNA 含目的基因 使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 2 将目的基因导入动物细胞 方法 显微注射技术 操作程序 提纯含目的基因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物 常用受体细胞 受精卵 3 将目的基因导入微生物细胞 常用法 Ca2 处理 常用受体细胞 大肠杆菌 微生物作受体细胞原因 繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对少 过程 Ca2 处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA 用Ca2 处理 增加细菌细胞壁的通透性 处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞 1 目的基因的有无 2 分子杂交技术 3 目的基因是否翻译 4 生物性状的表达与否 目的基因是否表达 个体水平 DNA分子杂交技术 目的基因是否转录 抗原 抗体杂交 分子水平 四 目的基因的检测与鉴定 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 1 导入检测 目的 方法 DNA分子杂交技术 过程 首先取出转基因生物的基因组DNA 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记 以此做探针 使探针和转基因生物的基因组杂交 若显示出杂交带 表明目的基因已插入染色体DNA中 四 目的基因的检测与鉴定 从转基因生物中提取的基因组DNA 探针 杂交的对象 用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段 15N 15N 14N 探针 转基因生物的DNA 变性 变性 14N 2 转录检测 目的 检测目的基因是否转录出了mRNA 方法 分子杂交技术 用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段 探针 杂交的对象 从转基因生物中提取的mRNA 3 翻译检测 目的 检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法 抗原抗体杂交技术 从转基因生物中提取的蛋白质 抗原 抗体 将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体 4 个体生物学水平的鉴定 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 1 转基因植物 杀虫的基因主要有Bt毒蛋白基因 蛋白酶抑制剂基因 淀粉酶抑制剂基因 植物凝集素基因等 抗病毒基因 病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因 抗真菌基因 几丁质酶基因和抗毒素合成基因 抗盐碱和抗干旱的调节细胞渗透压基因 抗冻蛋白基因 抗除草剂基因 转基因玉米中赖氨酸的含量比对照提高30 转基因延熟番茄储存时间可延长1 2个月 转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色变异 1 3基因工程的应用 2 转基因动物 如转外源生长激素基因绵羊和转外源生长激素基因鲤鱼生长速率快 体型大 如将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组 使获得的转基因牛分泌的乳汁中 乳糖的含量大大减低 而其他营养成分不受影响 目前 已在牛和山羊等动物乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶 血清白蛋白 生长激素和 抗胰蛋白酶等重要药品 科学家正试图利用基因工程方法对猪的器官进行改造 抑制抗原决定基因的表达 或设法除去抗原决定基因 再结合克隆技术 培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官 3 基因工程药物 1 来源 转基因的 2 成果 抗体 激素等 3 作用 预防和治疗 心血管疾病 各种传染病 糖尿病 类风湿等疾病 4 基因治疗 1 方法 把 导入病人体内 使该基因的表达产物发挥功能 2 效果 治疗 的最有效的手段 3 分类 基因治疗和 基因治疗 工程菌 细胞因子 疫苗 人类肿瘤 遗传病 正常基因 遗传病 体内 体外 基因治疗的方法 体外基因治疗 从病人体内获得某种细胞 进行培养 然后 在体外完成基因转移 再筛选成功转移的细胞扩增培养 最后重新输入患者体内 直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法 体内基因治疗 用于基因治疗的基因种类 正常基因 从健康人体上分离得到的功能正常的基因 用以取代病变基因 或依靠其表达产物 反义基因 即通过产生的mRNA分子 与病变基因产生的mRNA进行互补 来阻断非正常蛋白质的合成 自杀基因 即编码可以杀死癌变细胞的蛋白酶基因 干扰素是动物体内合成的一种蛋白质 可以用于治疗病毒感染和癌症 但体外保存相当困难 如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸 就可在 70 条件下保存半年 给广大患者带来福音 1 蛋白质的合成是受基因控制的 因此获得能够控制合成 可以保存的干扰素 的基因是生产的关键 依据蛋白质工程原理 设计实验流程 让动物生产 可以保存的干扰素 预期的蛋白质功能 预期的蛋白质结构 应有的氨基酸序列 相对应的脱氧核苷酸序列 基因 1 4蛋白质工程 2 基因工程和蛋白质工程相比较 基因工程在原则上只能生产 的蛋白质 不一定符合 需要 而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础 通过 或 对现有蛋白质进行 或制造一种新的蛋白质 以满足人类的生产和生活需要 3 蛋白质工程实施的难度很大 原因是蛋白质具有十分复杂的 结构 自然界已存在 人类生产和生活 基因修饰 基因合成 改造 空间 或高级 4 对天然蛋白质进行改造 应该直接对蛋白质分子进行操作 还是通过对基因的操作来实现 原因是 应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造 首先 任何一种天然蛋白质都是由基因编码的 改造了基因也就是对蛋白质进行了改造 而且改造过的蛋白质可以通过改造过的基因遗传下去 如果对蛋白质直接改造 即使改造成功 被改造过的蛋白质分子也无法遗传 其次 对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作 难度要小得多 蛋白质工程与基因工程 从预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 找到相对应的脱氧核苷酸序列 基因 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 定向改造或生产人类所需的蛋白质 定向改造生物的遗传特性 获得人类所需的生物类型或生物产品 可生产自然界没有的蛋白质 原则上只能生产自然界已存在的蛋白质 高温变性 低温复性 中温延伸 加热到90 95 DNA双链的氢键断裂解旋为单链 降到55 60 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 升温到70 75 在DNA聚合酶的作用下 以四种脱氧核苷酸为原料 根据碱基互补配对原则合成新的DNA链 PCR反应过程 循环 PCR反应具体过程 原核细胞的基因结构 补充内容 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 不编码蛋白质 编码蛋白质 连续不间断 编码区 非编码区 原核细胞的基因结构 调控遗传信息表达 上游有启动子 下游有终止子 真核细胞的基因结构 补充内容 编码区 与RNA聚合酶结合位点 内含子 外显子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 外显子 能编码蛋白质的序列内含子 不能编码蛋白质的序列 有调控作用 上游有启动子 下游有终止子 非编码序列 包括非编码区和内含子 获取目的基因 例如血清白蛋白基因 构建基因表达载体 在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子 显微注射导入哺乳动物受精卵中 形成胚胎 将胚胎