DNA的定量测定(二苯胺法)实验报告.doc

DNA的定量测定（二苯胺法）实验报告1、 实验目的掌握用二苯胺法定量测定DNA含量的基本原理和方法。2、 实验原理 在酸性环境中加热，DNA被水解为嘌呤，脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸。其中脱氧核糖在酸性条件下，脱水生成羟基y酮基戊糖，后者与二苯胺作用呈现蓝色，在595nm处有最大光吸收。当样品DVA的含量在40400g范围时，光密度与DNA的浓度成正比。 样品中含有少量RNA不影响测定结果，但是蛋白质，脱氧核糖，阿拉伯糖和芳香醛等能与二苯胺形成各种各样有色物质，干扰结果。在反应中加入少量乙醛，可以提高反反应灵敏度。3、 试剂与仪器DNA标准液，二苯胺试剂，样品溶液试管与试管架，吸管与洗耳球，可见分光光度计4、 DNA标准液曲线的制作与样品DNA含量的测定1. 取8支洁净干燥的试管，按下表操作：编号12345678标准DNA溶液0.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.61.20.80.4二苯胺试剂4.04.04.04.04.04.04.04.0样品DNA溶液2.02.0混合后，于60度水浴中保温1h冷却至室温中，用分光光度计测定吸光值A595nm以DNA浓度为横坐标吸光值A595nm为纵坐标，绘制标准曲线，对照组标准曲线计算样品中DNA的含量5、 实验结果与讨论DNA标准试管123456试管1试管2Y：吸光度0.0000.1290.2600.3690.5180.6760.3990.386X：总DNA浓度（g）013.326.74053.366.7X1X2由图可知，标准曲线为y=0.0098x，则求出的X1=40.71g/ml,X2=39.39g/ml平均DNA浓度为40.05g/ml，含量n%=40.05/100%=40.05%分析：由实验的标准曲线求得的DNA浓度40.05g/ml，在40400g范围内，光密度与DNA的浓度成正比，用标准曲线求得的浓度为准确值，另外，由DNA的标准曲线的线性关系R2 = 0.9966，证明DNA光密度的关系密切，则求出的浓度也就比比较精确。但本实验测得的DNA含量比整体水平偏低，造成的原因可能是：1 在吸取DNA溶液样品时，未充分摇匀，便吸取2.0mlDNA样液，造成DNA含量不均，造成实验存在误差，另外，在加完试剂后，未摇后便至于60度水浴保温，造成二苯胺与DNA的脱水物结合不充分，造成吸光值的偏低，从而造成后续的计算，样品DNA浓度偏低。2 进行分光光度测量时，可能由于比色皿未充分洗涤，有少量自来水的残留，相当于稀释了样品浓度，使测得吸光值偏低。3 在吸取二苯胺试剂分别加入支试管时，由于采用了不同试瓶的二苯胺溶液，造成试剂间存在部分差异，导致的脱水物结合情况有所差别，影响最后吸光值的测定。6、 思考题. 如何定何判断某些样品是否有核酸？答：取了支试管，按下表操作（ml）：编号样液.蒸馏水.地衣酚.二苯酚.沸水浴中加热min观察试管内颜色变化，若管变蓝，管不变，则样品中含，若管变变绿，管无变化，则样品中含，若，管不变绿，则样品中不含，若样品中不含，含，管不变蓝，则样品中不含。. 实验中加入乙醛的目的是什么？答：加