生物技术综合实验报告(原生质体相关).doc

生物技术综合实验报告 （第一部分）实验一 工作液的配制、培养基配制、器皿洗涤及灭菌1、 实验目的 掌握各种工作液配制方法；了解植物培养基的构成及配制方法；掌握高温高压灭菌的方法。2、 原理 培养基是植物组织培养的基本条件，同时也是关键因素。 湿热条件(121的蒸汽，10分钟)能够有效地杀灭附着在玻璃器皿、器具以及溶液和培养基中的微生物达到灭菌的目的。3、 器具和试剂 灭菌锅，天平，电炉，微波炉，三角瓶，封口膜，移液管，移液器，量筒，烧杯，pH试纸，培养皿，滤纸，Parafilm封口膜。 琼脂，MS培养基大量元素，无菌水，葡萄糖，2, 4-D，IBA，KT （激动素），1M NaOH及HCl，卡那霉素，头孢霉素，乙酰丁香酮 。四、 实验内容 PH调节剂的配制、培养基母液的配制、培养基的配制、各种相关物品的准备（一）培养基的配制步骤1、取个干净烧杯，加入1/3-2/3左右的蒸馏水，用移液管取所需的母液加入烧杯。2、称取定量的蔗糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容。3、用NaOH或者 稀HCL调剂酸碱值。4、称取定量琼脂糖加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装。5、高压灭菌（121,15min-20min)。6、冷却，取出，备用。（二）棉花无菌苗培养基的制备1、取25 ml MS大量元素母液，称取葡萄糖15g、于1升的烧杯中，定容后调pH值为6.0，加入7.5g/l 琼脂煮沸。2、然后将其分装到100毫升的三角瓶中，每瓶40毫升。3、用封口膜封口后在灭菌锅中灭菌15分钟。4、灭菌后置于水平的工作台上冷却即可。要求：配制 1L（三）拟南芥无菌苗培养基的制备 1、拟南芥无菌苗培养基：1/2 MS大量元素+蔗糖10g/L，PH值6.0；加入7.5g琼脂高温高压灭菌。 2、0.1%琼脂糖：0.1g琼脂糖/100ml 蒸馏水；无菌苗培养基和0.1%琼脂糖均121高压灭菌15分钟。 3、另准备20套9cm培养皿，灭菌。 要求：配制0.5L，装1瓶灭菌，灭菌后培养基倒皿。五、注意事项 1、为了尽量减少人为的误差，必须严格按实验步骤进行操作，严格按照要求的量来配制工作液、母液及培养基。 2、应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。 3、所有装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养皿等都应当清楚地做上标记。 4、每小组的操作的具体事项请参照黑板上贴的任务分组。 5、爱护实验仪器及耗材，小心使用玻璃器皿，合理灭菌，因为灭菌耗时较长。实验二 无菌苗的制备1、 原理 化学灭菌：0.1%升汞(Hgcl2)溶液浸泡10分钟可以对棉花种子等外植体进行灭菌，84消毒液（2%的次氯酸钠）浸泡3分钟可以对拟南芥等小种子外植体进行消毒。 物理消毒：紫外灯消毒、酒精灯火焰或高温烧灼5min左右可有效杀死镊子、剪刀等不锈钢操作器具的菌类达到消毒的目的。2、 实验材料、器具和试剂棉花品种YZ1;拟南芥col-0野生型 灭菌锅，天平，电炉，三角瓶，封口膜，镊子，酒精灯，剪刀，移液管，超净工作台。0.1%升汞溶液，84消毒液，75%酒精3、 实验内容（一）拟南芥无菌苗培养基倒皿1. 取上次灭菌好的拟南芥培养基（500ml装），稍微拧松瓶盖，微波炉煮沸，边煮边摇动，至全部融化。2. 将上次灭菌好的9cm培养皿分开放置超净工作台（超净工作台需先打开）上。3. 将融化好的培养基分装于培养皿中（500ml/18-20皿），将皿至于超净台上吹干.。（二）共培养培养基的配制 成分 数量 成分 数量 MS大量元素 (20倍） 50 ml 2,4-D (0.1mg/ ml) 1 ml NH4NO3 (20倍) 50 ml 甘氨酸 (1000倍) 1 ml 微量元素 (100倍) 10 ml KT (0.1mg/ml) 1 ml 铁盐 (100倍) 10 ml 葡萄糖 30g/L 微生素 (1000倍) 1 ml PH值 5.85-5.90 肌醇 (100倍) 1 ml 依次加入上述物质，调PH值5.85-5.90，然后分装至2个500ml蓝盖瓶，每瓶加入4g琼脂，灭菌，灭菌后倒皿。（三）选择培养基的配制 共培养培养基 +卡那霉素50mg/L + 头孢霉素400 mg/L 灭菌后，待培养基凉至60度左右加入，混匀，倒皿。（四）棉花无菌苗的制备1、将棉籽用手术剪刀去壳（每人3颗，饱满无病虫害种子）。2、用0.1%的升汞灭菌13分钟。3、无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中。4、28条件下暗培养7天 （304培养箱）。（五）拟南芥无菌苗的制备 大量法灭菌：将拟南芥种子放入1.5ml离心管中，加入84消毒液：无菌水=1:1的混合液1ml，上下摇晃灭菌2min，弃消毒液；加入1ml 75%的酒精混匀1min，然后无菌水清洗4次；加入0.1%琼脂糖溶液悬浮种子，用移液枪涂布于拟南芥无菌苗培养基，吹干，封口。弱光培养两天至种子萌发，转至光照培养室培养两周（304培养箱）。五、注意事项 所有操作（除数种子）均在超净工作台上进行。六、实验结果一周后观察无菌苗的生长状况1、六瓶接种的棉花无菌苗中有一瓶被轻度污染，其余五瓶生长状况良好。2、拟南芥的无菌苗因涂布不均匀长势一般，幼苗较其他小组要弱小，叶片颜色较深。 实验三 愈伤组织的诱导及农杆菌介导的棉花遗传转化一、实验目的 掌握植物体细胞胚胎发生的基本理论；了解植物愈伤组织在诱导和分化过程中的形态学、细胞学特征；进一步巩固植物离体培养和无菌操作的步骤；掌握植物遗传转化的方法、理论；掌握根癌农杆菌介导的植物遗传转化技术。二、实验原理 植物细胞全能性：植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。 愈伤组织：胚性愈伤：呈淡黄色或者黄绿色，质地较均匀；细胞球状或近球状，细胞核大，细胞质浓 非胚性愈伤：呈褐色、白色粉末状或白色、绿色坚硬块状 ；细胞一般为长柱状等非规则形状，细胞核小，细胞质较稀 。 农杆菌介导转基因的原理：植物细胞在受伤后，创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达，导致T-DNA被剪切，加工，形成T-链蛋白复合体（T-复合体），通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进入植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。三、材料与用品 1、实验材料：棉花材料YZ1（上周做的无菌苗）、农杆菌菌株LBA4404。 2、用具： 超净工作台， 显微镜，载玻片，天平，三角瓶，封口膜，橡皮筋，镊子，酒精灯，培养皿，滤纸，剪刀，医用手术刀，摇床。 3、药品：诱导、共培养培养基，卡宝品红染色液，MGL活化培养基，LB培养基，乙酰丁香酮（AS）。四、实验步骤（一）棉花愈伤组织的诱导及观察 1、愈伤诱导培养基的配制（第1周已做） 2、无菌苗的制备 3、无菌苗的切取：选取培养7天左右健壮的无菌苗置于垫有滤纸的培养皿上，用解剖刀切掉子叶及生长点，切掉胚根及相连的约1/4的下胚轴，余下的下胚轴用作愈伤组织诱导的外植体，用解剖刀将下胚轴切成0.7cm小段。 4、外植体接种及离体培养：将切离好的外植体接种于愈伤诱导培养基上（每瓶约7段），平行放置，28光照培养，每天14小时光照，进行愈伤组织诱导及增殖培养。 5、愈伤组织继代（一个月后）：待培养一个月左右，将增殖后的愈伤组织连同下胚轴切断继代到分化培养基上，进行胚性愈伤组织的分化。 6、愈伤组织形态观察：分别挑取少量非胚性愈伤和胚性愈伤组织，置于载玻片上，滴几滴清水用镊子捣碎愈伤组织，然后滴加一滴卡宝品红染色数秒钟后，在显微镜下观察比较两者细胞学特征。（二）农杆菌介导的棉花下胚轴的遗传转化1、共培养及选择培培养基的配制（第2周已做，没倒皿的组倒皿）2、无菌苗的制备（第2周已做）3、农杆菌的活化（研究生帮忙做）：从超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化；按1:100的体积加入20ml LB液体培养基里摇菌，28暗培养36-48hr；将浑浊的农杆菌液涂布于LB平皿上，28暗培养36-48hr；把培养基表面菌落刮入装有20ml MGL培养基的三角瓶中（按1/1000比例加入AS），28、200rpm摇30min；OD值在0.5-1.5之间（估计）即可用于侵染。 4、下胚轴与农杆菌共培养：把无菌苗切成7mm茎段（同诱导程序），用镊子夹到经活化的菌液中进行侵染，摇匀，侵染10分钟；倒掉菌液，将下胚轴转入装有滤纸的灭菌培养皿中，吹5分钟使表面稍为干燥；再将下胚轴分散布于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21, 暗培养48-60小时结束共培养。 5、选择培养（48-60小时后）：把经过共培养的下胚轴用镊子转入选择培养基中，培养30天左右继代一次转入相同的选择培养基中。五、注意事项1、在切无菌苗时，一定要使用锋利的刀片,尽量做到一刀能切断，避免挤压茎段。2、无菌苗培养时间不宜过长（培养七天最好）。3、从超低温冰箱内取出的甘油管，应尽量减少其在冰箱外的时间，用完后尽快放回冰箱。4、侵染时下胚轴稍为干燥可以增加农杆菌的吸附。5、共培养后第一次进行选择培养时应尽量使培养的环境保持干燥，可以减少农杆菌的污染。6、整个过程均为无菌操作环境。六、实验结果： 1锥形瓶与平皿中的下胚轴生长状况均良好，观察到平皿中农杆菌介导转化的下胚轴有发黑的现象，而锥形瓶中诱导的愈伤组织则无发黑现象。2 两个平皿中的拟南芥均生长缓慢且幼叶发黄，推测原因可能与杂菌感染有关。 实验四 植物原生质体的分离、纯化一、实验目的 了解植物原生质体分离和纯化的原理；掌握植物原生质体分离和纯化的方法；掌握原生质体活力测定和原生质体计数的方法。二、实验原理植物原生质体是指细胞中去掉了细胞壁后的部分。植物细胞在纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶的作用下，细胞壁被消化。纤维素酶的作用是降解构成细胞壁的纤维素，果胶酶是用来降解连接细胞的中胶层，使细胞丛组织中解离出来，可以得到裸露的原生质体。原生质体在合适的培养条件下，能再生细胞壁，进行分裂、生长、形成愈伤组织，进一步分化成根和芽，长成新的植株，表现了植物细胞的全能性。三、材料与用品1、材料：棉花胚性愈伤组织，拟南芥叶片。2、器材和用具：低速离心机，血球计数板，不锈钢筛（140和400目），普通显微镜，玻璃试管及吸头。3、试剂：CPW9和CPW25溶液（高温高压灭菌），台盼蓝。四、实验步骤1、材料的准备 拟南芥无菌苗的制备（第2周已种）。2、原生质体酶解分离 （1）愈伤组织原生质体的分离：1g颗粒状、新鲜的愈伤组织于6cm培养皿中，加入6 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床,40转酶解14小时。 （2）叶肉原生质体的分离：取约2g拟南芥幼嫩叶片于6cm培养皿中，用解剖刀将叶片切碎，加入6 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，28黑暗条件下酶解4小时。3、原生质体的纯化 （1）酶解后的原生质体-酶混合物经双层不锈钢网（140和400目）去掉残渣加入CPW9M 洗涤，滤液在10ml 的玻璃离心管中离心45分钟（800rpm），使原生质体沉于管底，细胞壁等碎片浮在液面。 （2）弃除上清夜，原生质体加入2ml的CPW9M轻轻混匀。 （3）在另一离心管中加入6ml CPW25S 溶液，在其上轻轻加入混有原生质体的CPW9M溶液，离心45分钟（800rpm），原生质体在两液面形成一条带，其它的杂质及少量的原生质体沉于管底。 （4）将原生质体轻轻地吸出，转入另一试管，加入5ml CPW9M溶液洗涤，离心45min（800rpm）。 （5）去掉上清夜,再用 CPW9M 溶液洗涤，离心45min（800rpm），弃去上清液，加入1ml CPW9M溶液悬浮。4、原生质体活性检测 依红Y检测法：吸取少许原生质体悬液涂于载玻片上，滴一滴依红Y ，染色5分钟，轻轻加上盖玻片。在光学显微镜下观察，调整不同光源，取5任意视野分别总原生质体数和有活力的原生质体数。活力用暗视野下未染上色的原生质体数占同一明视野原生质体数的比例表示5、原生质体计数 （1）将血球计数板及盖片用水擦试干净； （2）用滴管吸取少许原生质体悬液，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖