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临沂大学2012届本科毕业论文2012届 分 类 号： 单位代码：10452本科毕业论文双水相萃取法在中药有效成分提取中的研究进展 姓 名 徐凤莲 学 号 200809820107 年 级 2008 专 业 制药工程 系 （院） 化学化工学院 指导教师 庄会荣 毕业论文中文稿用白色A4纸（210197mm），毕业论文稿纸四周应留足空白边缘，每一面的上方（天头）和左侧（订口）应分别留边25 mm，下方（地脚）和右侧（切口）应分别留边20 mm。 年 月 日1页眉：宋体、五号、居中，文字内容为临沂师范学院2010届本科毕业论文小三号、黑体、居中，两字间空两格摘 要本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本本文本文。下空一行，摘要内容：小四号、宋体，每段开头空二格，行距21磅。本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本。小四号、宋体、每两个关键词之间用分号隔开本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本。关键词：本文；本文本文；本文本文中文摘要、英文摘要、目录用、数字格式摘要内容后下空一行，小四号、黑体、顶格ABSTRACT整个英文摘要部分的行间距为固定值21磅小三号、Times New Roman字体、加粗、居中下空一行，摘要内容，小四号、Times New Roman字体，空4个字符An alternative process was developed to prepare smaller and nearly monodispersed thiol-stabilized platinum nanoparticles. without the addition of concentrated hydrochloric acid that was previously reported as essential for the transfer to take place.An alternative process was developed to prepare smaller and nearly monodispersed thiol-stabilized platinum nanoparticles. The procedure involves the reduction of a Pt(IV) particle size distribution and excellent stability in aqueous solutions.摘要内容后下空一行，小四号、Times New Roman字体、加粗、顶格；3-5个关键词用小写分号隔开，格式同上。Keywords: Platinum; Platinum; Platinum整个目录部分的行间距为固定值21磅目 录小三号、黑体、居中，两字间空一格1 基因治疗研究与应用概述1所有序号与内容之间空1个字符1.1 特异性外源基因的获得11.1.1 用分子生物学技术分离与克隆3一级标题，宋体小四，加粗，顶格1.1.2 用限制性内切酶酶切3页码要右对齐1.1.3 人工合成目的基因片段4二级、三级标题，宋体小四，行距：固定值，21磅。缩进2字符1.1.4 采用逆转录法获得Cdna42 关于基因治疗的伦理学问52.1 基因治疗的必要性52.2 基因治疗与人口的老龄化问题5附录6参考文献8谢辞9宋体4号为了使页码对齐，可按下面步骤操作：点击“插入”，选择“特殊符号”，选择“”，把点设为“小四号、Times New Roman字体”，然后采用复制、粘帖的方法，直致把整行全部填满。或直接复制上面的“”1 基因治疗研究与应用概述一级标题：黑体四号，顶格，间距段前0.5行基因治疗(gene therapy)是通过基因转移技术将外源正常基因导入病变部位的靶细胞并令其有效表达，以纠正或补偿基因缺失或异常，从而起到治疗疾病作用的一种新型医疗方法1。所有标题序号与内容之间空1个字符1.1 特异性外源基因的获得获得二级标题：黑体四号, 顶格基因治疗(gene therapy)是通过基因转移技术将外源正常基因导入病变部位的靶型医疗方法1。1.1.1 用分子生物学技术分离与克隆三级标题：宋体、小四号、加粗，顶格参考文献编号：录入5后标为上标5。基因治疗(gene therapy)是通过基因转移技术将外源正常基因导入病变部位的靶细胞并令其有效表达,以纠正或补偿基因缺失或异常,从而起到治疗疾病作用的一种新型医疗方法1。1.1.2 用限制性内切酶酶切1.2 靶细胞的分离与体外培养正文：小四号、宋体，缩进2个汉字，行距：固定值，21磅。靶细胞是接受外源基因的细胞。从被治疗对象体内取得靶细胞进行培养、增殖,以获得足够的靶细胞来接受外源基因。其它类型的体细胞如骨髓细胞、皮肤成纤维细胞、角质细胞、肝细胞和血管内皮等均可用于基因治疗。表格行距：单倍行距上、下两条线线粗为1磅，中间的线线粗为1/2磅表1与后面标题空1字符，表题字号为小四号、宋体、加粗 正文部分字数不少于4000字表1 基因治疗的必要性表的上下均空一行表的上下均空一行注：顶格，楷体5号注：表示与对照组相比p0.05表的内容均为宋体5号，表格居中、单元居中正文起用1、2、3、.数字格式 正文0.引言中药是我们中华民族的瑰宝，是我国劳动人民几千年来在与疾病作斗争的过程中，不断认识、逐渐积累起来的。中药我国古代人们战胜疾病最重要的武器，对于中华民族的繁荣昌盛有着巨大的贡献。为了方便研究，需要中药中的有效成分提取分离出来。目前国内外的提取分离技术已经非常成熟，而且提取技术的种类也多种多样。提取方法有浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法、水蒸气蒸馏法、升华法、超临界萃取法等。分离方法有两相溶剂萃取法、分配色谱法、凝胶过滤法、膜分离法、离子交换法、分馏法等。本文着重介绍的是双水相萃取技术。1.双水相萃取法的现状双水相萃取技术是近年来发展起来一的种新型的液-液萃取技术，引起了人们极大的重视。双水相现象是由Beijeronck在1896年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合时最先发现的，双水相萃取技术真正应用是在1956 年，即由瑞典伦德大学的 Albertsson 成功的运用双水相体系分离叶绿素。20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化开辟了新的途径。目前已广泛应用于物质的分离、纯化，因为双水相萃取技术是一种高效、温和而又易操作的分离技术。迄今为止，已被成功的应用于生物医药工程，天然产物分离纯化等方面。尤其是，双水相萃取技术在中草药有效成分分离纯化中的应用已经越来越得到人们的关注，也是当前研究的热门。2.双水相萃取法的基本概念2.1双水相萃取法的原理2.2双水相萃取法的特点双水相萃取法同传统的萃取方法一样，都是利用物质在两相间的分配系数不同而实现分离的。但双水相有其独特之处，譬如，双水相萃取法操作条件很温和，常温常压操作，不会引起生物活性物质失活或变性；对目标物的选择性强，分离过程简单，易于工业放大和连续操作；不存在有机溶剂残留、萃取时间短、经济等优点。聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度，以及体系的pH 值等多种因素都可以对被萃取物质在两相的分配产生影响，因此可以利用多种手段来使反应达到最佳条件,这也是利用双水相萃取法提取中药有效成分的试验进行研究的重要部分。3.双水相萃取法的应用3.1. 双水相萃取法在黄酮类提取中的应用3.1.1.双水相体系萃取分离杜仲黄酮彭胜, 彭密军等以高分子化合物聚乙二醇4000( PEG4000) /葡聚糖40000( D40)为双水相体系萃取分离杜仲黄酮,实验探讨了在保证杜仲黄酮与色素及其他杂质有效分离的情况下, 使得杜仲黄酮尽可能转移到下相, 从而达到最高提取率。由于双水相萃取法侧重的是如何提高目标产物萃取率, 而忽略了目标成分与杂质的分离问题。本实验则运用PEG/D40体系, 在保证分离效果的前提下, 系统地考察了该体系对杜仲黄酮的纯化情况, 旨在为杜仲黄酮的分离纯化和开发利用提供新方法。实验证明以11%PEG4000-8%D40作为杜仲黄酮的双水相萃取体系, 最佳条件为: 样品溶液8g, pH值为8, 温度60。加入杜仲黄酮含量为6.85%的样品溶液8g, 控制温度为60 、溶液pH为8。此条件下杜仲黄酮的萃取率 可达到75.82%。3.1.2.双水相系统纯化山楂叶中黄酮赵立辉等应用以水、乙醇和硫酸铵三者所形成的双水相系统，以脱除其中一些易溶于水和在高浓度乙醇中溶解度低的物质。并测定了以氯化铵、磷酸氢二钠、结晶碳酸钠和硫酸铵以及其加入量对分相的影响。其中，氯化铵的加入量对分相基本没有什么影响，而硫酸铵随着量的增加, 黄酮的百分含量逐渐增加, 损失率在逐渐减小。实验测得：在乙醇4mL+水5mL+硫酸铵5g+0.15g粗体物时所得到的黄酮含量最高,达到了50.9%, 同时回收率为81.6%; 在乙醇5mL+水5mL+硫酸铵5g+0.15g粗体物时可以得到最高的回收率89.2%, 并且此时的黄酮含量为47.6%。这是因为盐量越大时盐析作用越大, 上相的乙醇浓度就会越高, 所以含量也会随之增加, 回收率回随之升高。但硫酸铵加入量为5g始已经达到饱和的状态,所以硫酸铵的最大加入量为5g。3.1.3.双水相体系提取竹叶总黄酮左光德等利用超声提取法和双水相分离技术相结合的方法提取竹叶总黄酮，并研究硫酸铵和丙醇含量、超声时间以及液固比对黄酮提取率的影响。经试验找出分离的最佳双水相体系为:丙醇体积分数60%;(NH4)2SO4用量为0.35g/ml；随着超声时间的增加, 竹叶总黄酮提取率增大, 25min时竹叶总黄酮提取率达到最大, 之后随超声时间的增加总黄酮得率反而略有减少；在液固比为30：1的条件下,竹叶总黄酮提取率为2.03%,提取物中总黄酮纯度为31.3%,明显高于常规超声法。即此新方法的最佳实验条件为：超声时间25min、液固比为30：1。实验证明了超声与丙醇-硫酸铵双水相体系耦合法可以缩短提取时间、提高得率，具有良好的应用前景,值得推广应用。付艳丽等以超声提取技术与丙醇-硫酸铵双水相萃取体系进行耦合的方法，从傣族雅解药竹叶兰中提取总黄酮物质。并且运用Design Expert软件进行星点设计响应面分析法进行优化，来探讨竹叶兰总黄酮最佳提取工艺。得出竹叶兰总黄酮最佳提取条件为:丙醇浓度为55% ，超声时间为50min ，硫酸铵用量20%，总黄酮得率为3.53%。此结果充分说明了用该方法设计的最佳提取工艺的可靠性。3.2. 双水相萃取法在苷类提取中的应用3.2.1.双水相萃取法分离黄芩苷赵爱丽等选择非离子表面活性剂聚乙二醇( PEG)-K2HPO4-H2O双水相体系对黄芩苷进行富集,探究成相条件及温度, pH值,聚合物的分子量等不同因素对黄芩苷得率的影响。实验表明利用PEG6000/K2HPO4 双水相体系, 最大的分配系数可达29.8, 最大收率98.6%。黄芩苷大部分被分配在PEG相中。另外结果表明PEG的平均分子量愈大, 黄芩苷愈趋向于上相分配，即两相中亲水性差距增大,黄芩苷在上相中的分配率增大；pH值过高对黄芩苷在双水相中分配不利；温度对R和Y影响不很大, 但对分配系数K影响较大。试验得出最佳的分离条件为：PEG6000质量分数为26%, K2HPO4的质量分数18%, pH值为7. 0, 温度为30。3.2.2. 双水相萃取法提取橙皮苷文赤夫等研究橙皮苷在丙酮-(NH4)2SO4-H2O双水相体系中的分配特性及影响萃取率的因素。通过试验表明在90%丙酮与(NH4)2SO4 溶液体积各为10ml 的情况下，萃取效率最佳的条件为：(NH4)2SO4 用量4.0g、样品0.35g、pH为4，其萃取率为98.22%。橘皮中的橙皮苷主要进入有机相中，萃取率为98.22%。文赤夫等还进行了薄层色谱分析，在365nm紫外灯下，上相溶液与标准品的斑点Rf 值接近，下相溶液检测不到橙皮苷。3.2.3. 双水相体系萃取分离桃叶珊瑚甙彭胜等利用由高分子化合物聚乙二醇( PEG4000)与葡聚糖40000(D40)所形成的双水相体系萃取分离杜仲叶中桃叶珊瑚甙。经试验验证表明,最佳体系为是由质量分数为11%PEG4000和8%D40组成, 最佳萃取条件是样品8g, pH值为7,温度是60。他们的研究方法与传统方法相比,不存在有机溶剂残留，而且分相时间短、能除去大量杂质和固体物质、易于工程放大和连续操作等优点，对于生产操作具有重大意义。3.3双水相萃取法在酶类提取中的应用3.3.1. 双水相萃取法提取过氧化物酶黄燕华等研究了双水相萃取法应用于从白萝卜中快速提取过氧化物酶的可行性。通过双水相萃取法与传统盐析法的比较得出在比活方面传统盐析法所得酶约为双水相萃取法所得酶的1. 4倍,但在酶力方面双水相法酶蛋白的得率更高, 约为盐析法的1. 8倍。综合考虑聚乙二醇/硫酸铵双水相萃取法更具有操作意义，具有操作简单、快速、提取率高等优点。并且聚乙二醇可以回收再利用，十分经济环保，适合于工业化大生产以及对白萝卜的开发与利用。3.3.2. 双水相萃取法萃取生姜蛋白酶谢芳等以生姜为原料，研究双水相萃取技术分离提取生姜中生姜蛋白酶的提取条件。根据单因素试验，选取PEG浓度、磷酸缓冲液pH、磷酸缓冲液浓度3个因素进行正交试验，由方差分析可知，磷酸缓冲液pH和磷酸缓冲液浓度对萃取结果影响均为差异显著。利用单因素试验与正交试验进行优化，探究到最佳萃取方案为PEG分子量为4000，PEG浓度为20，缓冲盐pH为6.5，缓冲盐浓度为10。3.3.3. 双水相体系提取无花果蛋白酶冯自立等扩展双水相萃取方法应用领域，对PEG(polyethylene glycol)/(NH4)2SO4双水相体系萃取无花果叶中无花果蛋白酶的实验条件进行研究。通过对不同相对分子质量PEG相图的绘制，获得了PEG/(NH4)2SO4 体系组成基础数据。实验结果表明：两相体系中PEG相对分子质量为1000、PEG质量分数为20%、(NH4)2SO4 质量分数为19%、pH值为6、温度25时蛋白酶在两相体系中分配系数最高。3.3.4.双水相萃取法提取壳聚糖酶周念波等采用PEG-( NH4)2SO4双水相体系直接从Bacillus sp. LS发酵液上清液中分离壳聚糖酶。研究了体系中PEG分子量、PEG质量分数、( NH4)2SO4质量分数、NaCl 质量分数和pH值对壳聚糖酶分配系数及萃取率的影响。实验数据反映出：随着PEG相对分子量的增加, 壳聚糖酶的分配系数和萃取率均先增大后减小, 当PEG相对分子量为600时分配系数和萃取率均达到最大；（NH4) 2 SO4质量分数一定时, 随着PEG600质量分数的增加, 分配系数和萃取率均先增大后减小；PEG600质量分数一定时, 随着( NH4)2SO4质量分数的增加, 分配系数和萃取率均先增大后减小；随着pH值的增加, 分配系数和萃取率均先增大后减小, pH值为6.0时, 均出现最大值。在此条件下壳聚糖酶分配系数达5.91, 萃取率达88.7%。3.4.某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统（aqueous two-phase system,ATPS）。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又称双水相分配法。20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化开辟了新的途径。 双水相萃取的聚合物不相容性：根据热力学第二定律，混合是熵增过程可以自发进行，但分子间存在相互作用力，这种分子间作用力随相对分子质量增大而增大。当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大的分子间的排斥作用与混合熵相比占主导地位，即一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相溶性。 可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物与无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。 生物分子的分配系数取决与溶质于双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用。因此，分配系数是各种相互作用的和。 将2 种不同的水溶性聚合物水溶液（或聚合物与一定浓度的盐溶液）混合时，当聚合物浓度（或盐的浓度）达到一定值，体系会自然分成互不相溶的两相，这就是双水相体系。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异混合时就可发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离倾向也就越大。参 考 文 献引用内容不跨页时只注明引用页即可。如577.1 程焉平.转基因产品的安全性及其对应策略J.遗传,2001,(6):577579.内容为小四号、宋体、文字的行间距为固定值19磅。2 徐宗良，刘学礼；瞿晓敏.生命伦理学M.上海：上海人民出版社,2002.空1字符标点用半角,宋体1专著中的文献序号作者.专著名称M版本(第版不加标注)出版地：出版社，出版年，页码范围.例如：1 王敏.怎样撰写科技论文M.沈阳:辽宁人民出版社,1983:63.2期（报）刊中的文献序号作者. 文献名称J期刊名称，年，卷号（期号）:页码范围.例如: 1袁庆龙,候文义.显微硬度研究J.太原理工大学学报,2001,32(1):51-53.3论文集序号作者.论文题目C. 主编. 论文集名. 出版地：出版社，出版年：页码范围.例如：11陈送.五四