20121027组会报告.ppt

2012 10 27组会报告 dldhierarch 观点 前列腺素E2 PGE2 可以经由DNA的甲基化作用的途径使得某些抑癌基因和DNA修复基因沉默 从而促进了肿瘤的生长 DNAmethylation 概念 DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式 即在甲基转移酶的催化下 DNA的CpG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基 形成5 甲基胞嘧啶 作用 DNA甲基化可使基因沉默化 进而使其失去功能 DNA甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化 使DNA失去核酶限制性内切酶的切割位点 以及DNA酶的敏感位点 使染色质高度螺旋化 凝缩成团 从而失去转录活性 DNA甲基转移酶分类DNMT1 持续性DNA甲基转移酶 作用于仅有一条链甲基化的DNA双链 使其完全甲基化 DNMT3a DNMT3b 从头甲基转移酶 它们可甲基化CpG岛 使其半甲基化 继而在DNMT1的作用下全甲基化 从头甲基转移酶可能参与细胞生长分化调控 其中DNMT3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用 DNAmethyltransferase CPGisland CpGisland C G富集区 通常这些位点很容易发生甲基化 在人类基因组内 GC的含量大约为40 这些GC并不是平均分布在基因组内 在某些DNA片段上其含量可高达60 以上 而在另一些区域则只有33 左右 这种GC含量的差别 在基因表达的调控和基因突变上都可能扮演着重要的角色 在基因的末端和启动子区域通常存在一些富含双核苷酸 CG 的区域 称为 CpG岛 这些CpG岛不仅是基因的一种标志 而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构 正常细胞的CpG岛由于被保护而处于非甲基化状态 全基因组低甲基化 维持甲基化模式酶的调节失控和正常非甲基化CpG岛的高甲基化是人类肿瘤中普遍存在的现象 以往的研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一 而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的机制 通过检测结直肠癌样本中的各自mRNA表达水平发现PGE2和PGTS2 COX 2 和DNMT1和DNMT3B的表达是相关的 PTGS2 前列腺内过氧化酶2COX 2 环氧合酶2 是PGE2的介导物质 当身体组织受到某种刺激如外伤 感染等会活化环氧合酶 能够使花生四烯酸 Arachidonicacid 大量转变为PGE2等前列腺素 PEG2 前列腺素2前列腺素家族的类型之一 前列腺素依据分子结构的不同分为若干类型 目前已知至少有四种GPCR 即EP1 EP2 EP3和EP4 介导了PGE2的生物学功能 在LS 147T HCA7和HT 29细胞中 PGE2的存在能够导致DNMT1和DNMT3B的表达水平的增高从而说明PGE2能够导致细胞内部的DNA甲基化水平增高 WesternBlot技术的运用 tumorsuppressorCDKN2B Cyclin dependentkinase4inhibitorBCNR1 cannabinoidreceptortype1DNArepairgeneMLH1 MutLhomolog1 coloncancer nonpolyposistype2MGMT Methylated DNA protein cysteinemethyltransferase 在LS 174T细胞中PGE2导致了抑癌基因CDKN2B和DNA修复基因MLH1启动子区域CGI的甲基化 从而沉默了该基因 硫化测序PCR BisulfitePCR BSP 技术的运用 在LS 174T细胞中PGE2增强了抑癌基因CDKN2B和DNA修复基因MLH1启动子区域CGI的甲基化水平 甲基化特异性PCR MethylationspecificPCR MSP 目前 基因的甲基化研究主要结合亚硫酸氢钠处理和PCR技术 分为甲基化特异性PCR MethylationspecificPCR MSP 和硫化测序PCR BisulfitesequencingPCR BSP 技术原理 DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后 DNA双链中的 C 转化为 U 通过随后的PCR 将 U 转化为 T 但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的 C 发生上述转化 因此 根据经亚硫酸氢盐处理的DNA模板设计引物时 先输入感兴趣的DNA序列 程序将会显示2种序列 一种是输入的源DNA序列 另一种是硫化处理后的DNA序列 除了CpG岛上的5甲基胞嘧啶 5mC 之外 所有非甲基化的 C 都转换成了 T 根据转化后的序列设计引物 进行BSP和MSP 1 MSP DNA经亚硫酸氢钠处理后 所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基变为尿嘧啶 而甲基化的胞嘧啶无此改变 DNA的甲基化差异转变为序列差异 设计两对分别针对甲基化与非甲基化等位基因的引物 结合PCR扩增就可以将甲基化与非甲基化等位基因区分开 这种方法灵敏度高 对DNA的质和量需要少 2 BSP 甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢钠发生脱氨基后不会转变 用一对特异性引物扩增后测序 再与DNA原始序列比对确定甲基化位点 测序法克服了只能针对单个位点检测 并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点 可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测 硫化测序PCR BisulfitePCR BSP 证实了PGE2在蛋白水平及mRNA水平都抑制了CDKN2B和MLH1基因的表达 在LS 174T细胞中PGE2导致了抑癌基因CNR1和DNA修复基因MGMT启动子区域的甲基化 从而沉默了CNRI和MGMT基因 硫化测序PCR BisulfitePCR BSP 技术的运用 证实了PGE2在蛋白水平及mRNA水平都抑制了CNR1和MGMT基因的表达 SC19220 SC PTGER1 EP1 antagonist AH6809 AH PTGER1 3 EP1 3 antagonist ONOAE 208 ONO PTGER4 EP4 antagonist 当阻断EP4时 能够使得PGE2上调DNMT1及DNMT3B表达的能力减弱 PGE2特异性地通过受体EP4导致细胞内DNA甲基化的发生 分别敲除DNMT1和DNMT3B基因时 发现PGE2导致下调抑癌基因CNR1和DNA修复基因MGMT表达的能力变弱 分别敲除DNMT1和DNMT3B基因时 发现PGE2导致下调抑癌基因CDKN2B和DNA修复基因MLH1表达的能力变弱 观点 PGE2可以经由PTGER4 EP4 DNMT通路途径通过增强这些抑癌基因和DNA修复基因的启动子区域CGI的甲基化水平从而使得这些基因沉默 当对APC小鼠给予PGE2治疗时 能够在小鼠的结肠肿瘤上皮细胞中发现Dnmt1和Dnmt3b蛋白表达的增加 同时与对照组比较也发现了PGE2促进了肠道腺瘤数目的增加和尺寸的增长 BSP MSP 运用BSP和MSP两种方法 在结肠肿瘤的上皮细胞中还观察到了 PGE2增强了抑癌基因CNR1 CDKN2B和DNA修复基因MGMT MLH1启动子区域CGI的甲基化的效应 在蛋白表达水平和mRNA水平上也都证实了 当PGE2存在时 抑制了小鼠结肠肿瘤内的抑癌基因CNR1 CDKN2B和DNA修复基因MGMT MLH1的表达 PGE2能够沉默小鼠结肠肿瘤内的抑癌基因CNR1 CDKN2B和DNA修复基因MGMT MLH1 当对APC小鼠给予PGE2治疗时 能够在小鼠的结肠肿瘤上皮细胞中发现Dnmt1和Dnmt3b蛋白表达的增加 同时与对照组比较也发现了PGE2促进了肠道腺瘤数目的增加和尺寸的增长 PGE2增强了小鼠的结肠肿瘤上皮细胞内DNA甲基化效应 并且促进了肠道肿瘤的生长 推论 PGE2能够通过小鼠结肠肿瘤细胞内的DNA甲基化效应沉默抑癌基因CNR1 CDKN2B和DNA修复基因MGMT MLH1从而促进肿瘤的生长 DNA甲基转移酶抑制剂 5 aza 2 deoxycytidine 5 Aza dC 当对小鼠同时使用PGE2和Aza DNA甲基转移酶抑制剂 时 与对照组相比 发现Aza能够明显地减弱PGE2的促进小鼠结肠肿瘤生长和增强Cdkn2b的启动子区域CGI甲基化的能力表明 PGE2是经由调节CGI甲基化的途径来促进肿瘤的生长 在PGE2存在时 当对小鼠联合使用Celecoxib和Aza时 此时比单一使用任意一种抑制剂更能明显地抑制肿瘤的生长延展性给出了可能的临床治疗方向 celecoxib COX 2抑制剂 当PGE2存在时 能够使得COX 2抑制剂抑制小鼠肠道小腺瘤的能力明显减弱 表明 COX 2抑制剂的肿瘤抑制效应取决于PGE2 结论 PGE2能够通过小鼠结肠肿瘤细胞内的DNA甲基化效应沉默抑癌基因和DNA修复基因从而促进肿瘤的生长 计划和展望 体外部分 甲 首先重复文中的实验 看PGE2是否能够引起细胞中DNA甲基化现象的发生 即是否观察到是否能够引起DNMT1和DNMT3B的上调 由于之前的经验 觉得在第一步可以不急于深入 能够在蛋白水平上 通过westernblot的方法观察到现象即可 接下来当发现Lrp6能够reversePGE2上调DNMT1和DNMT3B的时 再去从更多角度加以验证 乙 其次看加入Lrp6之后 是否能够reversePGE2上调DNMT1和DNMT3B的能力 即Lrp6reverse了PGE2引起细胞内DNA甲基化现象的发生 乙 1 试图证明只是Lrp6的膜外或膜上片段和EP2通过某些片段的相互结合从而竞争性的抑制了PGE2与其受体EP2的结合 从而具备了reversePGE2引起细胞内DNA甲基化的发生的能力 乙 1 1 排除 Catenin在其中的作用 由于Lrp6会导致其下游的 Catenin的激活 为了验证只是Lrp6的膜外或膜上片段和EP2通过某些片段的相互结合 而非其激活的下游的 Catenin导致的加入Lrp6引起的reversePGE2引起细胞内DNA甲基化的发生 分别采取敲除 Catenin或者仅仅使用Lrp6 C观察是否此时仍旧具备reversePGE2引起细胞内DNA甲基化的发生的能力 乙 1 2找出究竟是何种Lrp6的膜外或膜上片段与EP2结合 乙 1 2 1先通过CO IP的方法初步筛选出Lrp6与EP2结合的片段 乙 1 2 2初步筛选出来的片段再通过诸如Far western和双色染色的免疫荧光技术进行验证 Far westernblotting实验原理Far westernblotting是一种基于westernblotting的一种分子生物学方法 在westernblotting中用抗体来检测目标蛋白 而在far westernblotting中用能够与目标蛋白结合的非抗体蛋白质 因此 westernblotting用来检测特定的蛋白而far westernblotting则用于检测蛋白质之间的相互作用 实验方法在传统的westernblotting中 凝胶电泳被用来从样品中分离蛋白质 然后这些蛋白质在blotting过程中被转移到膜上 目标蛋白在westernblot中被抗体探针识别 far westernblotting用非抗体蛋白来检测目标蛋白 通过这种方式 与探针结合的蛋白质就被检测出来了 探针蛋白经常通过一种表达克隆载体在大肠杆菌中被生产出来 探针蛋白可以通过一种常规的方法 放射自显影显现出来 它可以结合像His或FLAG的特殊的亲和标签或者蛋白质的特殊抗体 因此在凝胶电泳前将细胞提取液在煮沸的去垢剂中失活是检测不需要自然折叠状态的蛋白质相互作用重要方法 双色或多色染色的免疫荧光技术免疫荧光的原理首先把细胞进行固定 然后用待检测靶蛋白的抗体 一抗 与细胞内靶蛋白进行免疫反应 再用荧光素 如FITC和TRITC等 标记的二抗与一抗进行反应 这样就在细胞内形成免疫复合物 靶蛋白 一抗 二抗 结果靶蛋白被标上颜色 然后可用共聚焦荧光显微镜观测定位与共定位结果 免疫荧光技术的优点可用来检测细胞内源性蛋白的定位及相互作用 当然也可以对靶细胞进行转染表达目的蛋白 然后标记目的蛋白进行观测 免疫荧光技术的缺点是荧光相对较弱并且背景较高 结果受到干扰 所以这项技术不好掌握 为了结果的可靠性 要求严格设计阳性对照与阴性对照 乙 2充分验证所筛选出来的Lrp6蛋白片段也具有reversePGE2引起细胞内DNA甲基化的发生的能力 此时 可以采用文章中的其他实验进行深入研究 乙 2 1 首先证明加入筛选出来的Lrp6蛋白片段 Lrp6 X 后 能够使得DNMT1和DNMT3B上调 乙 2 2 加入Lrp