基因工程之基因操作的工具酶培训课件.ppt

3 3DNA聚合酶DNA聚合酶 能够催化脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的游离3 OH末端 使核苷酸发生聚合作用 而不从模板上解离 反应特点 1 以四种三磷酸脱氧核糖核苷 dNTP 为底物 2 反应需要模板的指导 加入的核苷酸由模板链所决定 3 聚合反应需要有引物存在 且引物要有3 OH游离基团 4 DNA链的生长方向为5 3 5 产物DNA链的性质与模板相同 半保留复制 DNA聚合酶只能在已有的核酸链上延伸DNA链 而不能从无到有开始DNA链的合成 种类 到目前为止 已从E coli中发现了PolI PolII PolIII三种DNA聚合酶 其中PolI和PolII的主要功能是参与DNA的修复过程 PolIII与DNA的复制有关 三种聚合酶中 只有PolI同分子克隆关系密切 3 3 1大肠杆菌DNA聚合酶I E coliDNAPolI DNAPolI是从大肠杆菌细胞中分离得到的 该酶是由单一多肽组成的球蛋白 MW 109000 直径 65 DNAPolI已得到高度纯化 从100kg大肠杆菌中可以分离到约500mg纯化的酶蛋白 每个成熟的大肠杆菌细胞中约有400个分子的PolI 1 DNAPolI在空间结构上有三个位点 1 DNA模板结合位点 结合模板 2 核苷酸 磷酸结合位点 结合引物 3 dNTP结合位点 结合底物 2 DNAPolI是一种多功能酶 1 5 3 的聚合酶活性催化单核苷酸逐个地结合到DNA模板的3 OH末端 沿着引物的3 OH方向按模板顺序从5 3 延伸 每分子DNApolI每分钟可以催化约1000个核苷酸的聚合 2 5 3 的外切酶活性只作用于双链DNA dsDNA 从5 端切割下一个个单核苷酸 3 3 5 的外切酶活性能从游离的3 末端降解单链DNA ssDNA 成为单核苷酸 通常对双链DNA不作用 在正常聚合条件下 该酶对dsDNA的3 5 外切酶活性受到5 3 聚合酶活性的抑制 但一旦出现错配碱基时 聚合反应立即停止 由3 5 外切酶迅速除去错误进入的核苷酸 然后聚合反应才得以继续进行下去 所以3 5 核酸外切酶活力被认为起着校对功能 对DNA复制的忠实性极为重要 3 E coliDNAPolI在基因工程中的用途 1 可用于填补dsDNA上的缺口 以便有效地进行DNA重组 2 用于DNA序列分析 3 用于制备DNA探针在DNA分子的单链缺口上 DNA聚合酶I的5 3 核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生 当外切酶活性从缺口的5 一侧移去一个5 核苷酸后 聚合作用就会在缺口的3 一侧补上一个新的核苷酸 随着反应的进行 5 一侧的核苷酸不断地被移去 3 一侧的核苷酸又按序地增补 于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动 缺口平移 NickTranslation 应用缺口平移法制备DNA杂交探针 其典型的反应体系是 在25 l总体积中含有1 g纯化的特定的DNA片段 并加入适量的DNaseI polI 32P dNTP和未标记的dNTP 脱氧核糖核苷酸酶I DNaseI 是一种内切酶 它能够水解单链或双链DNA 形成带有5 磷酸末端的单 寡 核苷酸 由于32P dNTP比较昂贵 所以一般都采用低浓度的32P dNTP 2 mol L 和高浓度的未标记的dNTP 20 mol L 而且就大多数实验的要求 使用一种32P dNTP就足够了 其他3种均可采用未标记的dNTP 或是用适量的未标记的dNTP稀释每种32P dNTP 改变反应体系中DNaseI的数量 可以控制32P dNTP的参入程度 一般希望有30 左右的32P dNTP参入DNA链 3 3 2大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段 E coliDNAPolIKlenowfragment 用蛋白酶将DNAPolI作有限水解 可得到分子量为75000dal和36000dal的两个片段 大片段即称为Klenow片段 它具有5 3 的聚合酶活性和3 5 的核酸外切酶活性 但失去了全酶的5 3 的核酸外切酶活性 Klenow聚合酶可以标记DNA片段末端 5 延伸末端 对于限制性核酸内切酶EcoRI切割后形成的5 延伸末端可用 32P dATP标记 而BamHI切割后形成的5 延伸末端可用 32P dGTP标记 3 3 3T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的一种特殊的DNA聚合酶 1 T4DNA聚合酶也是一种多功能酶 1 5 3 的聚合酶活性 2 3 5 的外切酶活性其外切酶活性比E coliDNAPolI的活性高200倍 3 取代反应活性如果在反应混合物中仅存在一种dNTP 则此酶的3 5 外切酶活性将从dsDNA的3 末端降解 直到互补于这个dNTP的碱基出现为止 然后在这一位置发生取代反应 2 T4DNA聚合酶在基因工程中的应用 1 以填充反应标记带有5 延伸末端的dsDNA片段 2 将DNA的3 延伸末端切成平末端 3 以取代反应标记带有3 延伸末端或平末端的dsDNA片段 4 以部分消化dsDNA法标记DNA片段作为杂交探针 链特异的探针 3 3 4逆转录酶是一种有效的转录RNA成为DNA的酶 又称RNA依赖的DNA聚合酶 其产物DNA称cDNA 即互补DNA 1 逆转录酶也是一个多功能酶 1 RNA依赖的DNA聚合酶以RNA链为模板 以带有3 OH末端的DNA片段为引物 沿5 3 方向合成DNA链 几乎所有真核生物的mRNA分子3 末端都有一段PolyA 故加入寡聚dT后 mRNA就可以成为逆转录酶很好的模板 由此可合成cDNA 2 DNA依赖的DNA聚合酶以ssDNA为模板 以带有3 OH末端的DNA片段为引物 沿5 3 方向合成DNA链 可在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA 3 外切RNA酶活性底物是RNA DNA杂交分子中的RNA链 其水解方向有两种 从RNA链5 末端外切 称5 3 外切RNA酶 从RNA链3 末端外切 称3 5 外切RNA酶2 逆转录酶在基因工程中的应用 主要用途是转录真核生物的mRNA成为cDNA 从而制备基因片段 3 商品化的逆转录酶有两种 1 禽成髓细胞瘤病毒 AMV 逆转录酶 2 Moloney鼠白血病病毒 Mo MLV 逆转录酶AMV逆转录酶虽能更有效地拷贝复杂的mRNA 但它有很强的外切RNA酶活性 而Mo MLV逆转录酶的外切RNA酶活性较弱 更有利于制备全长的cDNA 两种逆转录酶均无3 5 外切DNA酶活性 故不具备校对功能 在高浓度dNTP和Mn2 存在下 容易出现核苷酸错误掺入 3 4DNA和RNA的修饰酶3 4 1核酸酶SI1 作用特点 此酶是从米曲霉 Aspergillusoryzae 中提取的 可降解ssDNA或ssRNA 又称单链特异性酶 其降解产物是5 磷酸末端的单或寡核苷酸片段 核酸酶SI对DNA底物的活性比对RNA强 高浓度的核酸酶SI可从缺口 nick 或小裂缝 gap 处降解dsDNA 2 作用条件 需要Zn2 作为辅助因子 最适pH是4 5 这是与基因工程的其它工具酶不同的两个特点 3 在基因工程中的应用 由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴 因而在质粒的重建和DNA重组中被广泛使用 切除单链粘性末端 产生平末端 再用T4连接酶连接 切除cDNA的发夹结构 3 4 2末端脱氧核苷酸转移酶1 作用特点 此酶是从小牛胸腺中提取的 可催化单核苷酸转移到另一个DNA分子的3 OH末端上 不需要模板 其引物是带3 OH末端的ssDNA Mg2 为辅因子 平末端的dsDNA只有CO2 存在时才能作引物 2 在基因工程中的应用 在连接平末端DNA片段时加上互补的同源多聚物 同聚物加尾法 3 4 3外核酸酶III1 作用特点 此酶是从E coli中分离得到的 是一种从dsDNA的3 OH末端降解产生5 单核苷酸的外切酶 2 在基因工程中的应用 产生具有5 延伸末端的DNA片段制备特异的DNA探针 3 4 4外核酸酶Bal311 作用特点 此酶是从乳白短杆菌 Brevibaceriumaldidum 中提取的 能以渐进的方式从线型DNA分子的3 5 两端同时降解 产物是单核苷酸或寡核苷酸片段 底物可以是带延伸末端或是平末端的dsDNA 对3 5 两端的降解速度相同 2 作用条件 降解时需要Ca2 作辅助因子 以EDTA作螯合剂 可使Bal31失活 3 在基因工程中的应用 可用于组建DNA的物理图谱 以及造成克隆DNA分子的末端缺失 3 4 5T4多核苷酸激酶1 作用特点 此酶是从噬菌体T4感染的E coli中分离的 能催化ATP的 磷酸转移到DNA或RNA的5 OH末端上 2 在基因工程中的应用 可用于缺乏5 磷酸的待连接DNA片段的5 端磷酸化 反转录mRNA生成的cDNA 人工合成的DNA片段及PCR扩增得到的DNA都缺少5 磷酸基 在与克隆载体连接之前 需用T4多核苷酸激酶将DNA的5 磷酸化 3 4 6碱性磷酸化酶 碱性磷酸酯酶 1 作用特点 从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称BAP 从小牛肠中分离的简称CAP 它能特异性地切去DNA或RNA的5 磷酸 底物可