中药五类新药赤芍总苷制剂的临床前药学实验研究设计.doc

中药五类新药赤芍总苷制剂的临床前药学实验研究设计组员： 【实验目的】1通过赤芍总苷提取纯化与质量控制方案的设计和研究，掌握大孔树脂用于苷类成分纯化的主要影响因素和工艺参数的方法，掌握中药五类新药原料的质量控制方法及技术要求。2通过设计并完成中药五类新药赤芍总苷制剂的临床药学实验研究，掌握中药新药研究程序和中药新药申报资料的技术要求。3熟悉我国中药新药的分类、申报资料要求以及新药审批的基本程序。【实验概述】赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch的干燥根。味苦，性微寒。归肝经。具清热凉血，散瘀止痛的功效。常用于温毒发斑，吐血衄血，目赤肿痛，肝郁胁痛，经闭痛经，癥瘕积聚，跌打损伤，痈肿疮疡等症。1赤芍中的化学成分主要有苷类成分，有赤芍苷（约3.5%8%），苯甲酰芍药苷，芍药内酯苷，苯甲酰羟基赤芍苷，羟基赤芍苷，赤芍苷元，胡萝卜苷等苷，另外含有鞣质（约12.6%）、蔗糖、棕榈酸等参考中药鉴定书。赤芍药材所含丰富的苷类成分总称为赤芍总苷（TGP）。按干燥品计算，含芍药苷不得少于40.0%，赤芍总苷为单萜苷类化合物，有一定水溶性及醇溶性，对热光酸及碱较敏感，长时间接触，常会引起氧化，重排及聚合反应，导致结构变化，因此在提取，分离及贮存萜类化合物时，应注意尽量避免这些因素，水煎煮会破坏芍药苷等成分中药化学书。赤芍总苷（TGP）为赤芍药材的主要活性部位。体内实验表明，赤芍总苷可使实验性脑缺血模型小鼠的脑毛细血管通透性降低；增强断头小鼠神经细胞耐缺氧能力，显著降低脑耗氧量；改善脑缺血再灌注小鼠被动学习记忆能力，对脑缺血再灌注小鼠脑组织LDH的减少有一定抑制作用；抑制脑组织细胞膜质过氧化物MDA的产生，减少NO自由基的进一步生成，并能显著提高脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。体外实验表明，一定浓度的赤芍总苷对Caf，kcl和NMDA诱导的不同类型大脑皮层神经细胞钙超载损伤均有显著保护作用。此外，赤芍总苷还具有免疫增强作用，通过重建机体免疫功能而发挥抗肿瘤作用；对药物所致小鼠学习记忆障碍有明显的改善作用，同时对D-半乳糖衰老小鼠学习记忆有促进作用。实验书我国药品注册管理办法规定药品注册分为9类，其中5类为：未在国内上市销售的从植物、动物、矿物等物质中提取的有效部位及其制剂。具体的讲5类新药即国家标准中未收载的从植物、动物、矿物等物质中提取的一类或数类成分组成的有效部位及其制剂，其有效部位含量应占提取物的50%以上。本次实验研究的赤芍总苷制剂即为5类新药。【赤芍药材的质量检查】按照2010版中华人民共和国药典一部赤芍项下的项目对赤芍进行质量检查。1.性状本品呈圆柱形，稍弯曲，长540cm,直径0.53cm。表面棕褐色，粗糙，有纵沟及皱纹，并有须根痕及横向凸起的皮孔，有的外皮易脱落。质硬而脆，易折断，断面粉白色或粉红色，皮部窄，木部放射状纹理明显，有的有裂隙。气微香，味微苦、酸涩。2.鉴别（1）本品横切面：木栓层为数列棕色细胞。皮层薄壁细胞切向延长。韧皮部较窄。形成层成环。木质部射线较宽，导管群作放射状排列，导管旁有木纤维。薄壁细胞含草酸钙簇晶，并含淀粉粒。 （2）取本品粉末0.5g，加乙醇10ml，振摇 5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每 1ml含 2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录 B）试验，吸取上述两种溶液各 4l，分别点于同一硅胶薄层板上，以氯仿醋酸乙酯甲醇甲酸（40:5:10:0.2） 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。3.含量测定照高效液相色谱法（附录D）测定。 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（40：65）为流动相；检测波长为230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。 对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。 供试品溶液的制备 取本品粗粉约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，浸泡4小时，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10l,注入液相色谱仪，测定,即得。 本品含芍药苷不得少于 1.8。 【制备工艺研究】1. 工艺路线拟定粉碎赤芍饮片粗 粉乙醇提取提取液的预处理过大孔树脂柱纯化收集TPG洗脱液减压浓缩得浸膏干燥得粉末2.工艺条件研究2. 1提取条件的选择2.1.1粉碎考察饮片，粗粉，中粉三种规格对提取的影响。后续提取具体条件筛选后，在进行实验。粉碎度收膏率(%)过滤速率(ml/min)饮片粗粉中粉结果：粉碎度为 时，收膏率高且过滤时间短，宜将赤芍粉碎为 。2.1.2提取2.1.2.1溶剂选择生产中常用的溶媒主要有水和乙醇。赤芍总苷为萜苷类化合物，其水溶性及醇溶性均较好，可以采用水和乙醇作为溶剂。50 乙醇，70乙醇，水在同等条件下提取，比较提取物中的芍药苷含量溶剂芍药苷含量水60%乙醇70%乙醇结果：采用水作溶媒，糊化淀粉粒较多，过滤困难。采用 %乙醇提取的赤芍中芍药苷的含量最高，并高于药典中药材芍药苷含量不得少于20的规定。故不宜采用水作溶媒，选定以乙醇为溶媒提取。2.1.2.2提取方法选择用乙醇作溶媒的提取方法有冷浸法、渗漉法、超声提取法和回流法。关于芍药苷的提取工艺的研究近几年的报道较多，但文献报道多用不同浓度的乙醇或水加热回流提取，邓一鸣等还采取了超声提取的方法，但考虑到大生产的实际情况，选择乙醇回流提取法。2.1.2.3提取工艺条件筛选考察提取溶剂乙醇浓度（A）、用量(B)、 提取时间(C)、 提取次数(D)对PAE含量（评价指标）的影响 ,每因素设计 3水平 ,因此采用四因素三水平表(L934)。因素水平表 水 平因 素乙醇浓度（）乙醇用量（）提取时间提取次数12360%10倍2h370%80%8倍1.5h211h6倍 正交试验表及结果如下:试验号因素PAE含量ABCD111112122231333421235223162312731328321393321根据实验结果进行分析（略，得到实验结果后分析）得，乙醇提取的最佳工艺条件为：2.2大孔吸附树脂纯化条件的筛选2.2.1大孔树脂型号的选择赤芍中含有糖类、鞣质等亲水性较强的成分，根据TPG的理化性质，提取液经弱极性树脂吸附后,很容易用水将糖等亲水性成分洗脱下来,然后再用不同浓度的乙醇洗下被大孔树脂吸附的苷类,因此选择非极性的树脂型号参考见桂双英等文献。根据文献参考1，刘永刚，2王汀3李曼等文献查阅，得出的结论与此相符。适用于赤芍总苷纯化的大孔树脂有D140、D101 、DA201，并对其进行优选。上样液的预处理：乙醇提取后提取液在洗脱杂质的时候会洗脱出总苷成分，影响吸附过程，且上样浓度故不能直接上样，须先进行预处理。采取回收乙醇至无醇味的方法，回收乙醇后部分醇溶性强的杂质沉淀下来，然后抽滤后稀释浓缩液至浓度为0.5g/ml刘虹等文。大孔树脂的预处理：将新购D140、D101、DA201的3种大孔树脂进行以下操作，醇洗水洗5盐酸(HC1)洗水洗至中性5氢氧化钠(NaOH)洗水洗至中性，备用。静态吸附量和静态洗脱率实验（以考察其对芍药苷的吸附及洗脱能力）：取D140、D101、DA201大孔树脂各20 mL，加入上样液125 mL，不时振摇，放置过夜后抽滤，测定吸附后的上样溶液中的芍药苷总量，计算3种树脂对芍药苷的静态吸附力(gL)。将上述已饱和吸附的D140、D101、DA201大孔树脂，分别加入120 mL70乙醇，不时振摇，4 h后抽滤，测定洗脱液中芍药苷的含量，计算3种树脂对芍药苷的解吸率()，结果见表。树脂型号静态吸附力（g/L）解析率（%）D140D101DA201由表可以看出，在3种树脂中 具有较高的吸附力及解吸率，故选择 进行赤芍提取液的纯化。2.2.2上样量的确定用以上筛选大孔树脂120 mL装柱(径高比约为1：6)，水洗至无醇味后不断上样，每60 mL为1份收集下口流出液，测定每份中芍药苷总量，绘制芍药苷的泄漏曲线，结果见图芍药苷泄漏量（mg） 份数（份）由上图泄漏曲线上可初步确定：当上样液浓度为 mL时，泄漏点为第 份，折合树脂与生药的比为 (vw)。2.2.3树脂用量、柱径高比、上样流速的选择以树脂用量、柱径高比、上样流速为考察因素，参考文献AB-8实验等文设计水平和因素如下：水平 因 素树脂用量ml柱径高比上样流速ml/min空白 1 120 1：8 1 2 100 1：7 2 3 80 1：6 3正交试验及结果如下：试验号因素吸附量（mg）ABC空白111112122231333421235223162312731328321393321 通过以上数据的直观分析和方差分析，影响吸附量的主次顺序为： ， 对吸附量有显著影响，筛选最佳工艺条件为：2.2.3洗脱液的选择取 6份赤芍已处理好的上样液,缓慢加入6支所选择的大孔树脂柱,平衡 2 h,水洗 ,UV定性检测水洗液是否含有 PAE至 Molisch反应呈阴性且洗脱液澄清 ,分别改用 10 , 20 , 40 , 80，90等不同浓度乙醇洗脱 ,UV定性检测 PAE并确定收集洗脱液体积 ,以 HPLC检测 PAE含量 ,以PAE含量作为评价指标。实验结果如下表：洗脱液PAE含量 水10乙醇20乙醇40乙醇80乙醇90乙醇取处理好的大孔吸附树脂 D101和 DA201各 100 g,分别装入层析柱 (3cm100cm)中备用。乙醇提取的干膏各4 . 0 g,加热水溶解后 ,滴加入大孔树脂柱 ,平衡2 h,加水洗脱 ,UV检测是否有 PAE洗出。水洗至近无色 ,再分别用20的乙醇洗脱 ,以 UV定性检测 ,收集含 PAE洗脱液 ,以HPLC检测PAE含量，以PAE含量为评价指标。得到结果显示：2.2.4大孔树脂再生树脂的再生通常采用80%左右的含水醇、酮或含有酸、碱的含水醇、酮进行洗涤,再生效果也很好,本实验使用后的MAR用 95乙醇洗脱至呈灰白色,用常水冲洗至乙醇味,或加稀碱浸泡 24 h,常水冲洗至中性 ,显浅灰色，干燥，备用。张虹,柳正良,王洪泉,等. 大孔吸附树脂在药学领域的应用 J . 中国医药工业杂志. 2001, 32 (1) : 412 44. 。3制备方法及工艺流程图（以上条件研究实验完成后确定）3.1制备方法： 取赤芍药材100g ,粉碎成粗粉(过20目筛 ) ,加a倍量b%乙醇,浸渍 0.5h,回流 c h,抽滤分离出提取液,提取 d次,合并滤液。回收乙醇至无醇味，然后抽滤后稀释浓缩液至药材0.5g/ml，即为上样液。取e大孔吸附树脂f g，另取g柱，湿法装柱，然后醇洗水洗5盐酸(HC1)洗水洗至中性5氢氧化钠(NaOH)洗水洗至中性,备用。将缓慢加到处理好的大孔树脂柱上,平衡2 h, 先水洗，UV定性检测水洗液是否含有 PAE至 Molisch反应呈阴性且洗脱液澄清法，改用 洗脱至 PAE量很少 (UV检测 )，UV定性检测 PAE并确定收集含 PAE洗脱液，浓缩得浸膏 ,置干燥箱,干燥 24 h即得。3.2制备工艺流程（按照制备方法，具体筛选条件确定后完成）【赤芍总苷的质量标准研究】1.性状本品为 粉末；气 ；味 。2.鉴别薄层色谱鉴别：2.1、赤芍总苷样品供试液制备精密称定赤芍总苷约60mg, 置25ml 容量瓶中, 加20%乙醇( 由无水乙醇与亚沸水配定)溶解, 稀释至刻度, 摇匀, 密塞, 即得。2.2、芍药苷对照品溶液制备精密称取芍药苷对照品约20mg,置10ml 容量瓶中, 加20%乙醇( 由无水乙醇与亚沸水配定)溶解, 稀释至刻度,摇匀, 密塞，即得。2.3、薄层鉴别吸取赤芍总苷样品供试液、芍药苷对照品溶液各4l, 分别点于同一硅胶G 薄层板上, 以氯仿- 醋酸乙酯甲醇甲酸( 405100.2)为展开剂展开, 取出晾干, 喷以5%香草醛硫酸溶液, 加热至斑点显色清晰, 则供试品与对照品在相应的位置上显相同的蓝紫色斑点。3.检查3.1、水分：照水分测定法（附录IX H第一法）测定，不得过5.0%。3.2、重金属：取本品1g，依法检查（附录IX E第二法），不得过百万分之二十。4含量测定 按照高效液相色谱法测定。4.1、测定条件的选择4.1.1检测波长的选择： 根据文献获知，芍药苷在230nm处有较大吸收，以此为检测波长可获得较高的灵敏度和良好的选择性，故选择230nm为检测波长。4.1.2色谱条件的选择：根据2010年版中国药典收载的赤芍药材中芍药苷的测定条件，拟用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温40。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。4.1.3流动相的选择：选用甲醇-水(50：50)、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(40：65)两种流动相进行比较，以分离度，保留时间，理论塔板数为指标，确定流动相。流动相保留时间分离度理论塔板数甲醇-水(50：50)甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(40：65)4.2、对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器干燥36小时的芍药苷对照品适量,精密称定，加20%乙醇( 由无水乙醇与亚沸水配定)制成每1ml含200.0g的溶液，即得。4