实验动物与药理、毒理学研究及药品质量安全.ppt

GMP 药品生产质量管理规范GSP 药品经营质量管理规范 GAP 中药材生产质量规范 GCP 药品临床试验管理规范 GLP 药物非临床研究质量管理规范 毒理学安全性评价网 中国药物毒理学年会 1 3 实验动物替代方法在药物安全性评价中的应用 药理和毒理研究中动物实验设计和实施注意的问题 Forscientific ethicalandeconomicreasons itisimportanttodesignanimalexperimentswell toanalyzethedatacorrectly andtousetheminimumnumberofanimalsnecessarytoachievethescientificobjectives 目前在新药研发的动物实验方面存在一些低质量的研究试验工作 一是所用动物的质量不高 二是研究人员在动物实验设计和实施方面的训练不足 三是实验动物福利观念不强 都是导致工作质量低 实验结果科学性不高的重要原因 动物实验设计的主要目的一是保证所测变量的任何差异是由处理造成的 而不是其他非对照变量引起 另一个目的是通过控制确定的变量在尽可能小的范围内 减少所测反应的变异性 这样对处理效应的评介更准确 随机 对照 重复三原则 一 控制变量变异性的挑战 1 由于生命形式的化学过程 代谢 非常复杂 2 动物对环境影响的积极适应 从遗传学方面讲动物的稳定性也是较差的 3 实验动物福利法规对动物使用数量的限制 一 实验者带来的差异一是与正确恰当的实验操作有关 如 注射 灌胃口服 外科手术等 一致性 准确性 完整性二是缺乏准确的测量手段 仪器测量 多次测量 二 动物带来的差异动物来源的差别动物饲养管理的差别生活在不同的环境动物健康状况动物之间相互作用引起的差异 微生物的控制分类 无菌动物 GermFree GF 悉生动物或已知菌动物 Gnotobiotics GN 无特定病原体动物 SpecificPathogenFree SPF 通常动物 Conventional CV 三 正确设立对照过多的变量 如遗传 环境 感染因子 对动物实验的结果产生影响 因此设置对照动物消除这些外来变量或可能未知的变量带来的影响 1 阳性对照 作为一个标准测量各实验组间差异的程度 另一个是用来证明动物反应是可探测的 为实验方法提供质量控制 2 阴性对照 期望正常状态不产生变化 阴性对照的目的是保证未知变量对实验组动物引起相反的效应不存在 即排除假阳性结果 3 空白对照 模拟处理组过程而实际上没有给予受试物或处理 4 媒介物对照 在测试化合物溶于一种媒介时 这种研究要使用媒介物对照 与给测试物的方法一样 只给予媒介物 5 比拟物对照 属于阳性对照 用一个已知的的处理来对比待测处理 以此来确定新的药物或处理是否有改善和提高 四 完全随机化设计依赖于用一个保证每只动物有均等可能接受任何处理的过程 只有这样才有可能将实验差异和可能的偏差减少到最小 从而得到可靠的结果 1 实验分组的随机化 必须将动物随机分配到实验各组 以确保研究的变量在各组中不会导致偏差数据 2 动物空间放置的随机化 实验动物生活的微环境因素 如 笼或架上的有效空间 即动物所占据的空间 微环境的差别 例如 与进风口和排气口的相对位置不同 垂直位置不同 会造成物理 化学和微生物组成的空间差异 这些情况我们在进行随机化安排时也应加以考虑 3 试验处理时间和测量时间的随机化在同一天的同一时刻处理所有的动物或测量反应是不可能办到的 处理动物的顺序也应是随机化过程的一部分 以保证所有处理动物和处理时间以及反应测量之间的差别以均等的几率散布在所有的处理组中 只有这样才有可能对实验差异和可能的偏差减少到最小 从而得到可靠的结果 4 完全随机化的方法1 每一只动物有一个固定的编号 进行 暗箱 抽数 并随机分配它们到不同组中 2 利用随机数字表或计算机随机程序 分模块随机化方法 分模块是为了控制一个或更多独立变量 并用来指导实验者进行一定操作的方法 这些独立的变量可能是实验用动物的特征 如性别 或窝仔 或是实验的环境因素 如 笼或架上的有效空间 实验者可以将动物分成模块 各模块内的动物尽可能在这些特征方面一致 然后将每个模块中的动物随机分配到不同的组中 五 动物实验中辅助变量的应用1 辅助变量的定义除实验中限定或主要目的反应变量外 可以收集的其他变量的总称 它与目的反应变量不一定有直接关系 包括被记录但在实验设计中不利用的变量 以及不引入到对主要实验反应变量正规分析中的变量 2 引入协变量分析的辅助变量指那些可以测量但不容易控制又影响反应的变量 在统计学分析时可以采用变形的方式减少它对实验结果的影响 例如 实验中观察某个指标的增加情况 可以在统计学分析中以增加的百分率形式进行比较 可以减少初始值差异对结果的影响 3 利用辅助变量探测局外数据局外数据或极端数据 对分析有不利的影响 扰乱统计分析的结果 导致产生错误的结论 但不幸的是 对于这些数据的探测和判定和处理还没有一个明确的解决办法 动物体重的动态监测和记录常常是GLP要求的 当局外数据被探测出来 它们应该同时从统计学和生物学的角度审查 首先 对实验记录应该进行检查 确定这个数据是否正确 如果没有证据证明是转抄或记录错误 那么应该将这个数据进行包括和排除两种情况的数据分析 以了解这个数据对结论是如何影响的 如果这个值被排除 那么排除的原因应明确表明 并写入实验报告 4 应用辅助变量评价随机化过程对实验结果解释的统计学技术 其有效性是基于每个观察与其他观察在统计学上是相互独立的假设 这个假设就是我们常说的随机将处理分配给动物的过程 对这个假定的违背可严重影响任何结果的有效性 辅助变量为评价这个假定条件的有效性提供了一个办法 5 利用辅助变量评价观测的一致性在整个实验过程中 GLP和动物饲养规范要求在许多时间点观察动物 这些观察的结果应该记录并与每只动物的实验记录放在一起 而且进行此项工作的人员应签名确定 6 利用辅助变量解释实验之间的差异为了能使实验独立地进行重复 实验的条件必须限定和清楚地描述 它必须包括实验动物的详细描述和至少辅助变量的总结 一些辅助变量的差别是各个实验室之间实验结果差别的原因 因此在进行实验室之间结果和作这方面的解释时 辅助变量信息的重要性就体现出来了 二 实验动物福利和动物实验伦理性要求的挑战 实验动物福利 一般强调保证动物健康 快乐的外部条件 当外部条件无法满足动物的健康 快乐时 就标志着动物福利的恶化 满足实验动物的需求是保障动物福利的首要原则 动物的需求主要表现在以下三个方面 维持生命需要 维持健康需要和维持舒适需要 对待实验动物疼痛的伦理学原则但最重要的还是我们应当树立正确的伦理学理念 其次才是了解掌握这些原则的应用和实践 相等原则 EqualityPrinciple 正当性原则 JustificationPrinciple 价值原则 ValuePrinciple 1 行为学和外观1 体重变化体重变化指标一般包括两项 一是体重的减轻程度 二是饲料 饮水消耗减少程度 动物经历疼痛会变得食欲不振 采食量减少 体重减轻 一般体重减轻在原体重的10 以下 动物经历疼痛为轻度 减轻在10 25 疼痛为中度 减轻超过25 疼痛为严重 paindistresssuffering 2 身体外观身体外观指标也包括两项 一是身体姿态 二是皮毛状况 一般啮齿类和兔形目动物经历疼痛时都会出现拱背的身体姿态 局部实施外科手术的动物 我们还可以观察到身体受影响部位的疼痛特征 如将身体较小重量放在受伤肢体的姿态改变或行走步态改变 还可能对受伤部位舔 抓挠 和咬的状况 当然这些状况也有可能是身体局部瘙痒引起的表现 皮毛状况 主要观察毛发是否紧贴皮肤 光滑 毛发竖立 皮毛粗糙 脱毛 掉毛 都可能是疼痛的影响造成 3 临床症状临床症状包括可观察到的异常行为和生理学指标 疼痛可能引起动物呼吸急促 流涎 涕 震颤 痉挛 排尿 瞳孔扩大 打喷嚏 流 红泪 等不正常的生理学变化 也可引起自残 侵略性和发声增加 躺卧不动等异常行为症状 4 非刺激行为非刺激行为包括与同类个体互动交流的社会行为 以及发声状态 疼痛会导致动物与其它个体的互动交流的社会行为减弱 比如互相追逐玩耍 互相梳理毛发行为的减弱 甚至厌恶同类 并可能改变原来正常的发声方式和状态 发出的声音可以用哭喊 尖叫 嚎叫和狂叫来描述 5 对刺激的反应对刺激的反应主要是指受到外界刺激时动物的反应行为表现 经历疼痛的动物在受到外界刺激时一种是反应性行为降低甚至没有任何正常的行为反应 而另一种是肢体警戒姿态 攻击性行为 吃仔 或抓咬挣扎 非人灵长类 鱼 运输等 2 生理学疼痛引起的生理学指标的改变 有的需要一定的测量手段 比起用眼睛观察的指标显得复杂了一些 但对疼痛的评估和判定是非常有帮助的 包括体温 心跳 呼吸 血细胞计数 血细胞分类 心输出量 血流量等 疼痛引起的植物神经系统的反应 导致血压和心跳增加 瞳孔扩大等生理学指标的变化 也会使肌肉张力 Muscletone 肢体温度改变 体表血流量增加 3 生化和生理学指标一样 在一般性的实验动物饲养管理和动物实验中并不常用来作为疼痛评估和判定的依据 但在一些特殊的研究中 生化指标是重要的评价依据 尤其用在对痛苦的评估和判定 包括血清中促肾上腺皮质激素 ACTH 皮质类固醇和儿茶酚胺升高 性类固醇下降 但是它们与疼痛的关系并不是最精确的 可能其它的应激因子也会引起类似的生化反应 表新环境中可能引起动物应激的因素 微环境因素 实验操作对动物伤害程度评分系统 SI系统 一个完善的SI系统 为我们在实际应用的水平 找到了对实验操作危害动物分辨和评价的一个全方位的视角 增加了人们对实验过程对动物不良作用的认识 以及对动物需要的关切 目前SI系统只用于评价操作技术层面的因素 实际上在其它研究领域如毒理学 免疫学和肿瘤学都建立和应用标准化的操作规程 这为我们应用SI系统评价其它众多的标准化操作提供了很好的基础 SOP 应急预案 手术准备 实验终点 定期检查 社会结构 安乐死 基因治疗 临床前评价 生物技术药物 采用不同表达系统的工程细胞 如细菌 酵母 昆虫 植物和哺乳动物细胞 蛋白质 多肽及其衍生物或由其组成的复方包括细胞因子 纤维蛋白溶解酶原激活因子 重组血浆因子 生长因子 融合蛋白 酶 受体 激素和单克隆抗体等也包括化学合成多肽 从 人 组织提取的单组分的内源性蛋白 生物技术药物 常规的药物安全性评价方法和模式并不都适用根据生物技术药物的特点 采取灵活 个案处理和科学的方法评价其非临床安全性 基因治疗 临床前评价 需要在5个特殊方面评价其治疗的安全性 DNA RNA生物分布 基因转移和生物学活性 基因垂直传播的危险性 载体的安全性 产品蛋白质的安全性 基因治疗的临床前评价 评价DNA RNA生物分布 放射性标记 DNA印迹 SouthemBlot 聚合酶链式反应 PCR 实时PCR realtimePCR 原位PCR lnsituPCR 基因治疗的临床前评价 评价基因转移和生物学活性 免疫 组织 化学 蛋白质印迹 WesternBlot 酶联免疫吸附试验 ELISA 流式细胞仪 基因治疗 三 评价垂直传播的危险性 传播到性腺 如果是 然后观察精液 生殖细胞 如果是这样 它存留多长时间 传播到血液循环中 可能要求用任何方法检测 基因治疗的临床前评价 评价垂直传播的危险性 发现一个适当种属动物模型 评价载体颗粒的急性毒性 兔子 a 在高剂量 潜在过敏反应 在小鼠不能发现 b 寻找嗜中性粒细胞的增殖 基因治疗的临床前评价 评价产品蛋白质的安全性 根据临床前药理学毒理学研究的数据对于许多产品遗传毒性试验是不适当的 用评价在一个哺乳动物细胞中整合 插入频率替代 标准啮齿类致癌试验可能是不适当的 基因治疗的临床前评价 具体问题具体分析 临床适应症基因表达时限肿瘤的清除可能要求短期治疗 如一个自杀性基因的短期表达 缺失酶的替代治疗终生表达 基因治疗的临床前评价 载体 在基因治疗中 典型的基因应用工具是病毒或非病毒载体应该对完整结构进行试验已知载体有害效应时 不再作单独的安全性评价 探讨作用机制例外 基因治疗 载体的安全性评价 静脉给药全新的非病毒载体缺乏毒性和基础药物动力学信息的证据 该载体的安全性评价是临床前试验必须的 基因治疗的临床前评价 载体和基因的相互作用 非病毒性载体载体颗粒的物理化学特征在很大程度上决定哪一个组织摄取量病毒性载体如何复制 如何复制终止 对过程评价 基因治疗的临床前评价 首次剂量的研究 原则 重现性拟临床给药途径 剂量对剂量 动物对人 的原则 首选单一适当动物种属 如果应用病毒载体时 动物应该对野生型病毒的感染敏感非人类灵长类不是首选 最初 应选试验室常用的种属仅在证明这些种属不适当时 才应该考虑应用灵长类具有一个狭窄治疗指数时应该探讨几个剂量水平 基因治疗的临床前评价 给药途径 单次静脉内给药拟治疗途径是腹腔内给药 i p 该产品应用在一个开放性创面或注射进入肌肉或肿瘤内任何可能偶而进入血管内如果拟临床途径不是静脉内给药 没有经静脉给药的研究 将说明理由 基因治疗的临床前评价 应探讨基因产品的生理学效应 特别是应用完全全新基因产品时应进行所有标准的毒理学评价 包括体内功能性终点的检测 包括心血管和呼吸效应等 基因治疗的临床前评价 基因和基因产品的分布 评价该基因的分布检测方法必须特异性和敏感性证明是否基因产物在特殊组织表达 证明基因表达的时间过程 基因治疗的临床前评价 特别关注生殖系细胞发现有分布 要详细的检查性腺 以确定是否该基因在实际的生殖细胞内出现在基因存留时间短的地方 例如在非整合非复制性载体 在适当时间点对性腺的检测将使假阳性发现减少到最低程度 基因治疗的临床前评价 临床上可能应用多次循环治疗 而不是单一周期给药治疗动物研究中应该平行于循环治疗方案 可以高达最大的三个循环 在最后试验循环完成之后 随后受试动物的研究时期应该根据基因表达时期而定 可以最长6个月 基因治疗的临床前评价 不应该盲目采用一组检测和观察应根据单次给药研究的早期发现 应该选择适当研究增加给药次数可能产生免疫反应 给药部位的淋巴细胞浸润 基因治疗的临床前评价 一般不推荐或不要求遗传毒性和致癌性研究一般不推荐典型生殖和发育毒性研究具体问题具体分析 如果治疗是拟用于控制一个长期代谢性疾病和病人存活达到生殖能力时 才进行该研究 基因治疗的临床前评价 药物相互作用研究一般是不适当的针对酶的基因前体药物治疗 涉及表达活化特定药物前体酶的基因 要求药物相互作用研究局部 希望的药理学效应 和全身 不希望的效应 活性代谢产物的潜在毒性 基因治疗的临床前评价 载体是已知安全完整的载体则载体的评价不是重点载体改变 要求全部的安全性评价载体框架改变但不改变载体的安全性特征 同样给药途径和类似的给药方案 根据基因正在表达的情况 删简试验可能是合适的载体中的启动序列或靶序列改变 基因产物的表达相当大的改变 该载体应该被认为是个新载体 即使它可能与先前载体具有同样基因 疫苗评价的指导原则 同其它生物技术产品的要求 无菌 无热原和无病毒污染 用适当种属进行毒性研究 检测对疫苗的免疫反应 如果用于怀孕妇女和可能生育的妇女 用适当动物种属进行1 段生殖毒性研究 策略 1 在毒理学与药理学方法比较中 首先识别毒性的潜在靶器官建立相关效应的标准通常根据应用参照物试验 选择适当的体内或体外试验模型评价相关的毒理学反应 策略 2 应该选择的剂量是建议人应用治疗剂量的合理倍数 特别是在许多情况下 能够获得试验物质的量可能是有限的 不可能获得公斤量 临床前啮齿类或灵长类研究应该仅提供在1期临床试验期间监测的指标 毒理学家的关注 1 纯度 污染物出现的量和类型 与天然分子产品的同源性 毒理学家应该关心在发酵或产品分离过程中被有意或无意引入污染物的可接受性和毒性 可能改变分子的三维结构或抗原性的氨基酸残基的引入 在分离和回收过程中 产品部分变性 在生产期间 突变可能导致氨基酸序列改变 rDNA克隆的遗传稳定性和外源DNA出现水平 毒理学家的关注 2 免疫原性 人类重组DNA蛋白质免疫原性的性质问题和对正常人类蛋白质产生抗体的潜力 例如在16个给予rDNA衍生的 干扰素 克隆A 的病人中 有3人产生了IgG类型的抗体 但是在治疗前或治疗期间不能检测到这些抗体在体外能够中和干扰素活性 尽管在体内中和干扰素效应还未被证明 因为 干扰素存在几个不同亚型 有些含有的表型在它们自己干扰素亚型上不出现 毒理学家的关注 3 常规猪胰岛素治疗的所有病人产生了抗胰岛素抗体用更高纯化的猪或rDNA人类胰岛素治疗 产生的抗胰岛素抗体频率较少 滴度较低最终目的是开发比纯化动物来源的且具有较小免疫原性的rDNA产品 毒理学家的关注 4 种属特异性rDNA蛋白质免疫原性的精确机制还不清楚 但是认为 在合成过程中 增加了额外的氨基酸残基 宿主将它读做为外来物 天然分子的变性 大肠杆菌多肽或脂多糖的污染 毒理学家的关注 5 重组蛋白质诱导的抗体的潜在危害 中和生物学活性 自身免疫病 过敏反应 诱导的抗体能够中和用于替代或补充治疗的内原性激素或蛋白质 毒理学家的关注 6 给药途径与重组蛋白质的免疫原性 皮下或肌肉注射的rDNA蛋白质可改善蛋白质免疫原性的过程 静脉途径给药产生较低的抗体反应 设计一个安全性评价项目 应该从考虑特殊的性质和三个过程的重要危害开始 生产系统 处理方式 产品本身 生产系统和处理方式 系统由真核细胞组成 明确它们的起源 它们的谱系 排除生产菌株中外来病毒 感染 DNA和 慢病毒 生产过程的物理 如过滤 或化学 pH 溶剂 亲和分离 性质 rDNA产品中插入基因和启动子的性质 核甘酸序列 是否仅存在一个阅读框架 任何内含子如何被操纵 动物模型 1 种属选择是最重要的考虑 要求理解该产品的生物学 是人类蛋白质或是靶人类受体 它们趋向于种属特异性 在啮齿类和犬中的研究 以及在传统毒性研究中常用的种属不能提供科学上有意义的数据 非人类灵长类不一定是最恰当的种属 不管它们的种系发生类似于人类 动物模型 2 动物疾病模型的研究可以考虑 给予人类重组红细胞生成素与慢性肾衰病人的高血压有关 也与尿毒症犬的高血压有关 动物模型 3 特异性免疫学试验要选择模型时一定考虑种属差异 在人类 抗CD4单克隆抗体 MAb 将结合在表达CD4的单核细胞上 随后与补体结合并破坏抗原程递细胞 因为CD4分子不在鼠单核细胞上表达 因此这些效应在鼠模型中将不会出现 研究设计 毒性研究考虑的重要问题是 给药的频率和途径 包括全新投递系统的应用 给药周期 特殊毒性试验 给药频率和途径 生物技术衍生药物的临床试验可能比常规药物更复杂 给予受试药的途径和频率应该反映建议的临床应用 即使应用全新的投递系统的途径 试验周期 毒性研究的周期依赖于拟临床应用和疾病时期 在任何多次给药研究中 应该包括对抗体形成影响的评价 以及包括它们的中和能力 它们本身的抗体形成不应该是终止毒性研究的理由 特别是在抗体不中和或不改变该蛋白质药效学的情况下 通常在志愿者一次给药之前进行多次给药的研究 生物制剂许多临床试验是把威胁生命的疾病作为目标 因此认为单次给药毒性研究足以支持单次给药的临床研究 这个方法促进加快进入临床 但是它可能具有有限的应用 在许多情况下 存在忽视临床前数据的趋势 特殊毒性试验 1 除多次给药研究之外 要求安全性药理学研究获得潜在功能改变 获得可能的遗传毒性和生殖毒性 以及致癌性的信息重组蛋白质的种属特异性可能排除传统动物种属的应用如啮齿类和 或家兔在安全性药理学 生殖毒性和致癌性研究中的