食品安全与加工技术专题论文.doc

食品安全与技术加工专题论文食源性致病微生物及其预防措施摘 要：食源性致病微生物引起食品污染是食源性疾病发生的主要原因，在我国和世界各国造成了很多的食品安全事件。本文通过对食源性致病微生物致病机理阐述，提出了包括风险评估、提高检测技术、部门协作在内的预防措施。关键词：食源性致病微生物；检测技术；风险评估；管理建议食品中的生物性污染无论是在发达国家还是发展中国家都是影响食品安伞的最主要原因致病性微生物是对消费者健康危害最大的食品安全问题。因此引起了食品研究者的关注。1.食源性致病微生物食源性致病微生物是通过摄食进入人体内的各种致病因子引起的、通常具有感染性质或中毒性质的一类疾病。食源性疾病包括食物中毒、肠道传染病、人畜共患传染病、肠源性病毒感染以及经肠道感染的寄生虫病等。食源性致病微生物暴发的定义是“两人或两人以上在进食同种食物后患相同疾病，通常是胃肠道疾病，经过调查确系食品所引发的”。 据统计,在食源性疾病中,由致病菌引发的食物中毒是食品安全的主要问题1。1.1致病微生物的种类常见食源性致病菌有沙门氏菌属、致泻性大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、肉毒梭状芽孢杆菌及肉毒毒素、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和空肠弯曲菌等微生物，另外还有一些病毒2。1.1.1沙门氏菌属沙门氏菌属，属于肠杆菌科，包括近2300个血清型，为革兰氏阴性杆菌，需氧或兼性厌氧，绝大部分具有周生鞭毛，能运动。可通过某种生化反应来鉴别分类，在生化反应中，一个重要的特征是产生硫化氢。沙门氏菌属的各菌种和菌株，可通过血清学技术（抗原一抗体反应等）来鉴别。与食品传染有关的细菌对人类和动物都能适应，致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌，其次是鼠伤寒沙门氏菌。食品的污染源可能来自被传染的啮齿类动物和昆虫。蟑螂和苍蝇通过接触传播沙门氏菌而不是通过排泄物。使用下水道的污物作为肥料也可能导致传染的循环。沙门氏菌能在被污染的土壤中残存几个月。另一个将沙门氏菌带入食物链的重要来源是动物性食品。可以传播沙门氏菌的食品种类极多，在生食品中主要有猪肉、家禽、蛋和蛋制品、乳及乳制品。许多报道都证以上实了猪肉、香肠这类食品中含有沙门氏菌。沙门氏菌委员会曾报道，50%以上的生香肠被沙门氏菌污染。1.1.2，大肠杆菌大肠埃希菌俗称大肠杆菌，是人类和动物肠道正常菌群的主要成员，每克粪便中含108个大肠杆菌。大肠杆菌为革兰氏每克粪便中约含有阴性杆菌，多数菌株周生鞭毛，能发酵乳糖及多种糖类，产酸产气，在自然界生命力强，在土壤、水中可存活数月。影响人类的大肠埃希菌菌株可以根据其是否产生肠毒素来划分为：产肠毒素型和肠发病型。产肠毒素型的血清型有时表现为霍乱型，即幼儿腹泻或旅行者的腹泻。肠发病型的大肠杆菌与结肠类有关或像志贺氏菌的大肠杆菌腹泻。1.1.3肉毒梭状芽孢杆菌肉毒梭状芽孢杆菌，简称肉毒梭菌，为革兰氏阳性、厌氧杆菌，在2025可形成椭圆形的芽孢。当pH低于4.5或大于9.0时，或当环境温度低于15或高于55时，肉毒梭菌芽孢不能繁殖，也不能产生毒素。食盐能抑制肉毒梭菌芽孢的形成和毒素的产生，但不能破坏已形成的毒素。提高食品中的酸度也能抑制肉毒梭菌的生长和毒素的形成。肉毒梭菌的芽孢抵抗力强，干热下180,515min，或高压蒸气125下30min方可致死。肉毒梭菌食物中毒是由肉毒梭菌产生的毒素即肉毒毒素引起。肉毒毒素是一种神经毒素，是目前已知的化学毒物和生物毒物中毒性最强的一种，对人的致死量为10-5mg/kg体重。肉毒梭菌广泛分布于自然界特别是土壤深处、江河湖海的淤泥及人畜粪便中，带菌土壤可污染各类食品原料，特别易于污染肉和肉制品。常被污染的食品有蔬菜、鱼类、豆类、乳类、肉类等；民间自制发酵豆制品如臭豆腐、豆酱、豆豉等；烧烤、涮等加热不彻底的肉类食品；腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品。这些被污染的食品原料在家庭自制发酵和罐头食品的过程中，加热的温度或压力不足以杀死肉毒梭菌的芽孢，且为肉毒梭菌芽孢的萌发与产生毒素提供了条件，尤其是食品制成后不经加热而食用，更容易引起中毒的发生。1.2细菌性食物中毒发生的原因(1)牲畜屠宰时及畜肉在运输、贮藏、销售等过程中受到致病菌的污染。(2)被致病菌污染的食物在不适当的温度下存放，食品中适宜的水分活性、及营条件使食物中的致病菌大量生长繁殖或产生毒素。(3)被污染的食物未经烧熟煮透或煮熟后又受到食品从业人员带菌者污染。1.3微生物引起食物中毒的发病机制细菌性食物中毒发病机制可分为感染型、毒素型和混合型三种。1.3.1感染型 病原菌随食物进人肠道，在肠道内继续生长繁殖，靠其侵袭力附于肠黏膜或侵入黏膜及黏膜下层，引起肠黏膜充血、白细胞浸润、水肿、渗出等炎性病理变化。某些病原菌如沙门氏菌进入黏膜固有层后可被吞噬细胞吞噬或杀灭，病原菌菌体裂解后释放出内毒素，内毒素可作为致热源刺激体温调节中枢引起体温升高，亦可协同致病菌作用于肠黏膜，引起腹泻等胃肠道疾病。1.3.2 毒素型 大多数细菌能产生肠毒素或类似的毒素，尽管其相对分子质量、结构和生物学性质不尽相同，但致病机理基本相似。1.3.3混合型副溶血性弧菌等病原菌，进人肠道后除侵入黏膜引起肠黏膜的炎性反应外，还可以产生肠毒素引起急性胃肠道症状。这类病原菌引起的食物中毒是致病菌对肠道的侵入及其产生的肠毒素的协同作用，因此，其发病机制为混合型。1.4污染途径微生物个体小，繁殖快，数量多，因此在自然界容易散布并且分布很广。上至天空，下至土壤、江河、湖泊以及动植物体表面，无不充满着各种各样的微生物。我们人类生活的自然环境到处都有微生物的活动。因此，食品从原料产地、加工、储藏、运输、销售以及烹调等各个环节，常因卫生条件不良而受到环境中微生物的污染，并在其中生长繁殖引起食品变质，甚至产生毒素造成食物中毒。微生物对食品的污染途径是多方面的，主要通过水、空气、人和动物、用具及杂物等。1.4.1通过水污染食品加工中水是不可缺少的，它既是食品的配料成分，也是清洗、冷却、冰冻等不可缺少的物质。天然水源包括地上水（海水、河水、湖水、池水）和地下水（深井水、泉水），其不仅可能是微生物污染源，也可能是微生物污染食品的主要途径，在很多情况下污染是通过水作为媒介造成的。有时遇到自来水管有漏洞、管道中压力不足以及暂时变成负压时，管道周围泥土中的微生物容易进入管道，若用这种水来处理食品，不仅会引起微生物污染，同时还有将其他物质带入食品中去的危险。在屠宰加工场中，经常可以发现屠宰后牲畜体表沙门氏菌检出率明显高于宰前牲畜粪便中沙门氏菌的检出率。原因在于一系列宰杀、除毛、拉肠的工序中，皮毛、肠道内微生物通过水的散布而扩散，这些微生物也经常通过用水造成相互之间污染，并通过污水的排出向周围环境扩散。食品生产过程中如果直接应用未经净化、消毒的天然水，则会有较多的微生物污染食品，同时还可能有其他污染物和有毒物品使食品污染。1.4.2通过空气污染空气中的微生物分布是不均匀的，空气中微生物的变动情况与灰尘变动的情况大体相似。随着灰尘，水沫的飞扬或沉降，将微生物附着在食品上。人的痰沫与鼻涕的小水滴中含有的微生物在讲话、咳嗽或打喷嚏时均可直接或间接污染食品。1.4.3通过人及动物污染人经常接触食品，因此人体可作为媒介，将有害微生物带入食品，造成污染，特别是人的手接触食品的时间最多，污染也最为常见。食品制造的从业人员，如果身体、衣服不经常清洗消毒，不保持清洁，就会有大量的微生物附着，通过皮肤、头发、衣帽与食品接触而造成污染。食品制造贮藏的场所也是鼠、蝇、蟑螂等一些小动物经常出没的场所。这些动物体表、消化道均带有大量的微生物，因此，它们也是微生物的传播者。1.5食品致病微生物的数量变化3食品中的微生物在种类和数量上会随着食品所处环境的变动和食品性状的变化不断地变动着，这种变动所表现的主要特征就是食品中微生物出现数量增多或减少，即食品中微生物的消长。食品中微生物在数量上出现的消长现象，通常可以分几个阶段。1.5.1加工前食品加工前，不论是动物性原料或植物性原料都已不同程度地被微生物所污染，由于运输、贮藏等原因，常造成食品污染的机会增多，以致原料中微生物不断增多。尽管有些微生物污染食品后，因环境不适应会引起死亡，但从微生物总数来看，一般不是减少而是增多。这种微生物增长的现象，在一些新鲜的鱼肉和果蔬类的食品原料中较为显著，即使食品原料在加工前的运输和贮藏等过程中，为防止污染，曾采取了有力的卫生措施，但早在原料产地已被污染而存在的微生物，如果不经过一定的灭菌处理，是不易除去的。从食品加工前后来看，加工前原料中含有的微生物不论在数量上或种类上，一般情况下，总是比加工后要多得多。1.5.2加工过程中食品加工过程中，某些操作措施对微生物的生存可能是不利的，特别是清洗、加热、杀菌或灭菌。在正常情况下，这些处理措施可使食品中微生物数量明显下降，甚至可使微生物完全被清除。但当原料的微生物污染特别严重时，微生物的下降速度就会减缓。在加工过程中食品也可能遭受到再次污染，即所谓二次污染。但在一般卫生条件良好的情况下，只会少量污染，故食品中的微生物总数不会有明显的增多。残留在食品中的微生物在加工过程中如能繁殖，也会出现微生物数量骤然上升的现象。1.5.3加工后食品在贮藏过程中，可能残存微生物或二次污染微生物，条件适宜，就会繁殖，使食品腐败变质。在食品变质的过程中，微生物数量会骤然显著增多。当食品中微生物所需营养物质缺乏，使变质后的食品不利于微生物生长，微生物会逐渐死亡，这时的食品已不宜食用。如在已变质的食品中，某些能适应其环境的微生物继续生长繁殖，也可能出现微生物数量再度升高的现象。制成的食品如果不再受污染，残存的微生物又不能生长繁殖，在贮藏过程中，微生物数量就会不断下降。食品多种多样，加工条件和贮藏条件也不尽相同，微生物在不同食品中所出现的消长情况也不可能完全一样。因此，在食品生产中必须充分了解食品中微生物消长规律，这对指导食品的安全生产和卫生检测具有重要的意义。2.检测技术随着人们对食源性致病微生物的日益关注与重视，食源性致病微生物监测已成为食品卫生学科的一个十分活跃的研究课题。在研究方法上，食源性致病微生物监测已广泛应用了流行病学、分子生物学和计算机等学科的最新技术和方法。2.1传统检测技术传统的细菌检验方法灵敏度高，费用低，能够得到食品样品中细菌数量和特性等方面的定性及定量结果。但是传统的检测方法耗时费力，获得结果通常需要几天的时间，并且要求所要检测的细菌增殖为可见菌落。培养基制备、细菌培养、菌落计数和生化指标的检测都增加了实验室的工作量4。2.1.1常规规方法的改进和自动化为了提高实验室的效率，使传统的琼脂培养方法能够更方便和经济实用，研究者们从食物样品的制备、平板技术、菌落计数和鉴定系统方面对相应技术做了很大改进并提高了自动化程度。2.1.2生物发光方法食物成分中的微生物含有ATP，可以通过荧光素酶复合物进行检测。试样所释放出来的光的强度和样品中ATP含量直接相关，并且可以通过照度计进行定量检测。这种方法至少需要104个细菌才能产生光信号。通过检测细菌和非细菌微生物的ATP，该方法可以用来检测器皿表面的清洁程度。从几秒到几分钟的快速反应时间使这种方法适用于在HACCP中进行实时监测5。目前许多公司已有ATP卫生监测试剂盒并且相互进行了对比研究6。上述方法也有缺点，pH、温度、荧光素酶抑制物的存在和其他一些因素都可能影响反应结果。当使用干洗系统或者样品中含有少量或者不含ATP时，ATP生物发光方法就不能用来进行卫生监测。2.1.3细胞计数流质细胞计数是一种以光学为基础的在复杂的基质中分析单个细胞的方法。悬浮在液体中的微生物通过激光束，光被散射并且被微生物吸收，散射的宽度和自然特性作为微生物的固有特性，可以利用透镜和光电元件收集散射光，进而评估微生物的数量、大小和形状。这种技术的灵敏度较高，可以达到每毫升102的酵母细胞或1023的细菌，几分钟内就可以获得实验结果。所以流质细胞计数适合检测液体中的微生物。2.1.4阻抗测定技术阻抗测定技术是利用微生物在培养基中生长和代谢时电导力的变化来测定的。电导力达到极限值所需要的时间、检测时间和接种物的初始量呈反比。现在，一些根据阻抗滴定原理的自动系统已经商品化。这些系统可以同时检测成百上千的样品，一些设备已经全部自动化并且计算机化，可以同时持续监测样品中的电导力的变化，结果以电导力曲线的形式出现，可以和校正曲线进行对比从而评估样品中微生物的数量，大部分的阻抗分析可以在24 h内完成。2.1.5免疫学方法免疫学方法的基本原理是抗原和抗体的特异性反应。为了检测特异性的微生物和微生物毒素，越来越多的抗体被应用于各种类型的免疫学反应。在免疫学反应中大部分的抗体来源于兔或羊血清。这些抗体主要依赖于他的特异性，多克隆抗血清含有不同细胞来源的各种类别的抗体，也就有不同的特异性。在免疫学反应中应用多克隆抗血涛的不利之处是动物免疫反应的可变性和特异性，单克隆抗体通过提供一致和可靠来源的特征性抗体从而促进了免疫学方法的发展。免疫学反应可以分为均相和异相反应。2.2分子生物学检测方法2.2.1DNA杂交在微生物诊断和鉴别方面一个重要的发展就是核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)探针的引进。使用抗体检测的特异性问题可以通过应用RNA和DNA探针来解决，后者可以和特定微生物的核酸相结合，所以阳性杂交结果和特定微生物的存在是一致的。尽管可以利用克隆的探针，但现在应用的大部分探针是合成的寡核苷酸。2.2.2PCR在20世纪80年代后期，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，vcR)作为生物技术的一个里程碑受到了科研人员的青睐。这是一种灵敏度很高的技术，理论上可以检出单个DNA拷贝。已经成功地应用于食源性致病菌的筛选和鉴定。其中，一些以PCR为基础的常见食源性致病菌的检测已经商品化，如Bio-rad公司的Probelia系统、Applied Biosystems公司的TaqMan系统和杜邦Qualicon公司的BAX系统。 2.2.3定量PCR常规的PCR方法只能得出定性的结果，从而限制了他的应用。随后发展的是定量PCR技术的发展，他包括和MPN相结合的非直接定量PCR和直接定量PCR。MPNPCR方法是将传统的MPN计数方法和PCR方法相结合，对样品中的靶细菌进行半定量。由于该方法在样品稀释、DNA提取过程中目的DNA的丢失和PCR扩增过程中抑制物存在的限制，只能给出保守的估计，也可以说是一种半定量方法。2.2.4实时PCR与定量竞争PCR不同，定量动力PCR应用的是外部标准。PCR产物随着循环数的增加而增加，根据比较标准和靶基因反应动力学斜率进而获得试样中靶基因的数量。这方面应用比较多的是实时PCR(Real Time PCR)。实时PCR可以监测PCR反应过程中每个循环扩增产物的量，和传统的PCR监测反应的平台期不同，他可以监测PCR的整个过程，包括指数期。他的定量数据来自于整个PCR反应曲线中呈现对数线性关系的那几个循环(3040个循环中的45个)。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。2.2.5基因芯片基因芯片(Micmarray)分析作为一种新兴的技术，很有可能在食源性致病菌的鉴定方面引起新的变革。在过去的10年中，已经有37种微生物的基因组序列被获得，还有128种微生物的序列正在测序中。随之而来的是快速筛选技术如DNA基因芯片技术，这种技术利用从细菌中扩增到的序列标记荧光作为探针。与固定在玻片上成千上万的DNA序列进行杂交。结果可以通过直接的荧光扫描或酶学方法进行测定。3. 监管现状摄入含有细菌或细菌毒素的食品便会引起食物中毒。消费者普遍认为农药残留、滥用兽药是最大的食品安全隐患，而实际上微生物引起的食源性致病微生物才是影响食品安全的主要因素，而且发病率呈上升趋势。美国每年约有万人发生食源性致病微生物，造成3500亿美元的经济损失。食源性致病微生物的全球患病率很难估计，仅2000年就有210万人死于腹泻，大部分归因于食物和饮用水的污染。此外，腹泻也是导致婴幼儿营养不良的主要原因，据估计美国每年大约有7600万例食源性致病微生物，其中32500人住院治疗，5000人死亡。据报道，工业化国家每年患食源性致病微生物的比例达30%。2000年，宁夏沙门氏菌污染肉品，暴发食物中毒，发病人数上千人。2001年，卫生部收到的食物中毒事件中，细菌性食物中毒人数最多，占总中毒人数的45.8% ，所造成的危害十分严重，如江苏、安徽等地爆发的大肠杆菌食物中毒事件，导致人死亡，中毒人数超过两万人。2001年，青海西宁铁路一中和广东省南海市南庄高中发生两起细菌性食物中毒，造成人中毒。食源性致病微生物流行速度快、影响范围广，对经济发展很大阻碍。 我国作为一个人口众多、居住拥挤的发展中国家，食源性致病微生物种类多、患病率高。由于公共卫生医师对食物中毒调查不及时，收检患者粪样、呕吐样及残留食物等样本的意识差或样本不可得，样本送检过程中处理不当，微生物检测技术水平低等原因，已有的食源性致病微生物报告体系并未得以有效运行。20世纪80年代，我国在开展传染病监测的基础上，陆续开展了非传染病监测和其它公共卫生监测，但尚未包括食源性致病微生物的常规监测，建立在常规监测基础上的主动监测及前瞻性流行病学调查更是一项空白，针对食源性致病微生物的监测工作和基础研究也是薄弱环节。由于上述基础资料的缺乏，加上我国信息沟通、公开体制方面的一些缺陷，我国公开发表的期刊杂志上所见的仅有食源性致病微生物的个案报告或爆发调查报告，食源性致病微生物发病率的详细或系统报道还不多见。4. 食源性致病菌微生物风险评估4.1微生物风险评估的原理风险分析是当前国际社会普遍应用的食品安全宏观管理模式,也是进行食品安全宏观管理的有效工具7。微生物风险分析由风险评估、风险管理和风险图1风险评估的流程图交流3部分组成8,9,其总体目标是确保公众健康。国际食品微生物标准委员会(ICMSF)指出:食品安全风险分析的3个重要组成部分是政府机构和行业部门建立食品安全目标(food safety objectives, FSO)的基础和依据10。微生物风险评估(microbiological risk assessment,MRA),是指对食品中微生物因素的暴露导致的人体健康不良影响的识别、确认、定性、定量,并最终做出风险特征描述的过程,其作用在于评价食品中病原微生物的风险及其影响因素。它不仅为评价和组织相关信息和资料提供了便利,更为准确预测暴露于危害后产生损害的可能性和损害的严重程度提供了一整套结构严谨、行之有效的方法。微生物风险评估的评估方法大致可以分为定性风险评估和定量风险评估两大类。定性风险评估是根据风险的大小,人为地将风险分为低风险、中风险、高风险等类别,以衡量危害对人类影响的大小11。而定量风险评估,是对风险的性质和严重程度的评估,根据危害的毒理学特征或感染性、中毒性作用特征,结合其它相关资料,确定污染物(或危害物)的摄入量及其对人体产生不良作用的概率,并对它们之间的关系进行数学描述。定量风险评估是风险评估的最优模式,其创新性就在于,基于预测微生物学和数学模型的定量风险评估量化了整个食品生产、加工、消费链中所存在的病原微生物危害,并把这一危害与因其所导致疾病的概率直接联系起来,其结果为风险管理政策的制定提供了极大便利。4.2微生物风险评估的步骤参照国际食品法典委员会(CAC)已经发布的食品微生物风险评估的原则与指南、微生物风险管理指南,微生物风险评估包括4个步骤:危害识别(hazard identification)、危害特征描述(hazardcharacterization)、暴露评估(exposure assessment)、风险特征描述(risk characterization)。目前国内外的风险评估案例中,危害识别多采用定性方法;其他3个步骤,国际上比较成熟的风险评估案例均使用了定量方法。从定性方法到定量方法的过渡,反映了风险评估这一研究领域的发展趋势。4.3风险评估研究进展随着评估技术的日臻完善,微生物风险评估将成为国家政府机构、国际食品安全和卫生组织对食品安全中的微生物危害进行评估的重要工具。目前,国际上对于微生物定性风险评估的研究相对比较成熟,而微生物定量风险评估则是当前的研究前沿。欧美等发达国家对于微生物风险评估的研究比较深入,并且已经以此为指导和依据,制定了多项食品中病原微生物限量标准和有效预防控制食源性疾病的措施,成效显著,收益巨大。我国这方面的研究虽尚处于起步阶段,但发展势头迅猛。5. 对我国食源性微生物致病管理的建议对食源性疾病的管理包括预防、调查、监测、治疗及其控制的全部内容，而通过提高食品卫生水平、加强食源性疾病主动监测为主要内容的预防性措施，已经成为相关国际组织和许多国家卫生当局所关注的内容。5.1加强管理规划，完善信息体系加强全国性食源性疾病的管理规划，开展地区性和全国性食源性疾病管理的网络建设。当前的重点要完善和加强食源性疾病调查、报告体系，建立更加快速、有效的信息处理和传递系统。将食物中毒与食源性疾病的报告体系有机结合起来，形成一套有良好效率和管理水平的报告、调查、分析体系，这对今后食源性疾病的管理至关重要。5.2开展与食源性疾病有关的致病因素的主动监测尤其是加强对重点致病因素和高危险性食品的监测。有些致病微生物， 如产气荚膜梭状芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌等是在其他一些国家经常引起食源性疾病爆发的因素，而我国很少报道，这可能与我国对这类致病菌的监测能力和重视不够有关。此外还应通过建立症状监测哨点开展对食源性疾病散发病例的监测和调查。5.3提高检测能力提高相关监测人员的知识水平和实验室检测能力， 尤其是提高对新致病因素的检测能力。例如，根据国内外对李斯特菌污染状况和致病情况的分析， 应当加强对该致病菌的重视。5.3提高信息处理能力进一步提高信息处理能力。食源性疾病的监测活动可以有多种形式，但最主要的是要对监测活动进行科学的计划、组织和实施，通过高效的信息处理能力， 提高对食源性疾病的预报和管理水平，建立食源性疾病预警系统。5.4加强部门之间的协作，共享监管资源充分了解与 “食品链”各阶段相关的危害因素及其发生的危险性，是开展“危险性分析” 的条件之一。当前应充分利用现有资源，加强不同领域、不同部门和行业之间的协作。既要在医疗和卫生机构之间开展协作，还要加大卫生医疗机构与农业、进出口检验检疫等部门之间的合作。首先应重视有效结合疾病控制和卫生监测两个方面的监测信息和资源。6.展望 随着食品致病微生物检测技术的进步和食品风险评估体系的建立与完善，致病微生物引起的发病率会逐渐的降低。但是对食品致病微生物的研究由于各种致病菌的变异和食品交易的全球化而出现了新的课