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硕士学位（毕业）论文微生物对油菜吸收土壤Cd效果的影响研究学位申请人：贾 莹指导教师：李博文 研究员学科专业：土壤学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二一年六月分类号： X131.3 单位代码： 10086 密 级： 公 开 学 号：2007299微生物对油菜吸收土壤Cd效果的影响研究Effect of Microbial inoculation on Cadmium Uptake by Rape学位申请人：贾 莹指导教师：李博文 研究员学科专业：土壤学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二一年六月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 河北农业大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解 河北农业大学 有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名： 导师签名：签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日学位论文作者毕业后去向：工作单位： 电话：通讯地址： 邮编：摘 要针对微生物促进植物修复Cd污染土壤的问题，采用温室盆栽试验，以自然污染土壤为供试土壤，以油菜为供试植物，在Cd污染土壤上接种能产生低分子有机酸的微生物JA1，JA2，JA3，JA4，研究了四种微生物菌株对油菜富集Cd的效果影响，优化出促进植物修复Cd污染土壤的微生物。主要研究结果如下：1. 通过对4株菌菌落形态的观察，初步判断均为细菌菌落，对照常见细菌鉴定手册作初步判断：JA1为反硝化利斯特氏菌（Listeria denitrificans），JA2为环状芽孢杆菌（Bacillus cirallans），JA3为干燥奈瑟氏球菌（Neisseria sicca），JA4为格氏利斯特氏菌（Listeria grayi）。2. 接种微生物后，各处理油菜都能顺利发芽正常生长，均无明显受毒害现象。A，B，C，D 处理在五个浓度梯度下油菜平均总鲜重及株高均大于对照处理，并达到显著水平，生物量较对照提高了10.9%29.1%。四种微生物菌液的浓度对植株生长均有一定的影响，A，B，D三种处理均呈现先增后减的趋势，而处理C呈现出递减的趋势。3. A、B、D处理的地上部富集量均大于CK，较对照分别提高了10.2%36.1%，32%48%，37%63%。而C处理的地上部富集量较对照降低了7%29%。各处理Cd的根系富集量约为对照的1.42.41倍。表明微生物菌株JA1，JA2，JA4对植物吸收土壤Cd有一定的促进作用，JA3对Cd浓度为3.1mgkg-1的污染土壤具有一定的原位修复效果。4. A，B，D处理的植物提取量均有所提高，分别较对照提高了50.0%，72.9%，65.5%；而C处理的植物提取量较对照降低了9.4%。A处理和B处理下，Cd的植物提取量随微生物菌液浓度的升高呈现先升高后降低的趋势；C处理下，Cd的植物提取量随菌液浓度升高而降低；D处理下，Cd的植物提取量随菌液浓度升高而升高。5. A，B，D各处理下，土壤有效态Cd含量均显著提高，较对照分别提高了25.9%，59.3%和41.9%；而C处理下土壤有效态Cd含量较对照降低了13.6%。 6. 不接菌对照的土壤pH为8.45，A、B、C、D处理下土壤pH平均值分别降低了0.39，0.53，0.47和0.62个单位，其中D处理降低的最多。表明微生物产酸能够使土壤pH有一定幅度的下降。7. 加入微生物后油菜叶绿素含量升高。A、B、C和D处理分别较对照提高了2.4、2.2、2.5、0.6个单位（SPAD）。各处理下植物组织中可溶性蛋白含量分别为3.61，3.64，3.50，3.37 mgg-1，均略高于对照，较对照提高了3.4%11.7%。处理A、B、C的VC含量分别为40.3，37.6，40.0 mgkg-1，较对照均有所提高，分别提高了26.3%，24.1%，和25.4%；而D处理下，油菜VC含量较对照下降了10.3个百分点。由此可以看出，接种微生物后，除个别处理外，油菜品质均未受到伤害。关键词：土壤污染；微生物；镉；油菜；品质目 录1.引言21.1农田重金属来源及污染现状（农田污灌）31.2土壤重金属污染的治理途径41.3重金属污染的生物修复技术41.3.1土壤重金属污染的植物修复技术及其特点51.3.2富集植物超富集植物51.3.3超富集植物富集机理和耐性机制61.3.4土壤重金属污染的微生物修复技术及其特点71.3.5微生物和植物的联合修复技术71.4土壤重金属镉对植物的影响82.材料与方法92.1供试作物和土壤92.2供试菌株筛选及鉴定92.2.1供试菌株筛选92.2.2供试菌株鉴定92.3试验设计102.4 样品采集与分析方法102.4.1植物和土壤样品的采集102.4.2 植物样品中镉含量的测定102.4.3土壤中全量镉和有效态镉含量的测定112.4.4其它指标的测定112.5数据处理113.结果与分析113.1 供试菌株的鉴定113.2微生物处理对油菜生长发育和生物量的影响113.2.1不同菌液对油菜生长发育和生物量的影响113.2.2微生物处理浓度对油菜生物量的影响123.3微生物处理对油菜Cd富集量的影响133.3.1微生物处理对油菜地上部Cd富集量的影响143.3.2微生物处理对油菜根系Cd富集量的影响153.4微生物处理对油菜Cd植物提取量的影响153.5微生物处理对土壤重金属Cd有效态含量的影响163.6微生物处理对土壤pH的影响183.7微生物处理对油菜品质的影响183.7.1微生物处理对油菜叶绿素含量的影响193.7.2微生物处理对油菜可溶性蛋白的影响193.7.3微生物处理对油菜VC含量的影响204.讨论205.结论21参考文献22在读期间发表的学术论文25作者简介25致 谢251.引言土壤是人类赖以生存、兴国安邦、生态文明建设的基础资源。随着快速的工业化、城市化、农业集约化发展以及全球变化，我国的土壤环境形势日趋严峻1。人类面临的资源，环境和食品安全问题都与土壤紧密相关。随着工业的发展，人类活动对环境的影响越来越大，其对土壤的污染也越来越严重。目前土壤与环境质量问题已成为当今全球共同关注的重大问题2。其中重金属污染因具有隐蔽性、潜伏性、长期性、易迁移和不可逆性而尤为引人注目。土壤重金属污染是指由于人类活动使重金属在土壤中的累积量明显高于土壤环境背景值或者土壤环境质量标准，致使土壤环境质量下降，农田生态环境恶化的现象3。我国受Cd、Cr、Pb、Ni、Hg等重金属污染的耕地面积已达2000多万hm2，约占总耕地面积的1/54。我国土壤资源的特点是是土壤类型多，绝对数量大，人均土壤资源拥有量少5。加强土壤重金属污染的修复技术研究，对于区域环境的改善和生态环境的保护、工农业的合理布局和规划以及人们生活水平的不断提高都具有现实性和理论意义6。治理污染土壤和恢复土壤生产力已成为我国可持续发展的必须解决的问题。在化学中，重金属一般指密度在4.5g/cm3以上的金属元素，而在环境污染研究中所说的重金属实际上主要是指汞、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重金属，其次是指有一定毒性的一般金属，如锌、铜、镍、钴、锡等。目前最引起人们关注的是汞、镉、铅、铬、砷，被合称为重金属污染中的“五毒” 7，而镉以毒性高和移动性大最受关注。镉在土壤中滞留时间长，又是生物迁移性很强的重金属，易被植物吸收并积累，并可通过食物链严重危害人类健康8。1.1农田重金属来源及污染现状造成农田和菜地土壤污染的因素主要有3类：一是工业区和人类活动密集区造成的污染颗粒在农田沉降而造成污染，以工业区周围最为严重9,10；二是利用未处理的城市污水进行灌溉而造成农田和菜地污染11,12；三是因肥料使用不当而造成的农田和菜地污染，其中以投入强度大的菜地污染最为严重13。我国是农业大国，农业生产又是用水大户，并且我国水资源总量与时空分布不均的情况下，农业生产缺水问题就更为突出。我国利用污水灌溉历史悠久。近年来，随着经济的发展，水资源缺乏己经成为影响区域经济发展和人们生活的重要限制因素，因此污水灌溉有其存在与发展的必要。现在，污水己经成为中国城镇近郊灌溉用水的重要水源，尤其是在干旱缺水季节，污水灌溉仍然是解决燃眉之急的重要途径14。污灌在北方旱作地区最为普遍，包括北京、天津、沈阳、济南、西安、石家庄、郑州、齐齐哈尔、沈阳、保定等一些著名的污灌区，这些地区占全国污灌面积的90以上15。调查显示，2001年河北省污灌面积达15.98万hm2，共有49个灌区，年引灌污水量7.73亿m3，占全省污水总量41%16。污灌虽能节约水资源，但同时也能带来大量的重金属，从而可能导致重金属污染，危害人体健康。因此，污灌地区土壤中重金属的富集是目前最为重要的污染问题之一17。长期或过量不合理污灌，会造成土壤和地下水的污染，农作物污染物富集，影响畜禽和人体健康，甚至使农田生态系统受到严重影响。据我国农业部对全国污灌区的调查，在140万hm2的污水灌区，遭受重金属污染的土壤占污水灌区面积的64.8%，其中轻度污染的占46.7%，中度污染的占9.7%，严重污染的占8.4%，以汞和镉的污染面积最大18,19。近年来，许多污水不经过处理或经过简单处理就用于农业灌溉，某些水质严重超标，严重威胁着农产品质量安全20。刘树庆21研究了保定市郊污灌区（20-30年污灌历史）土壤重金属铅、镉含量比清灌区有明显的增加，并接近或达到轻度污染程度。谢建治22等研究发现，保定市郊污灌区土壤及蔬菜体内重金属含量明显高于清灌区，蔬菜营养品质指标也表现出清灌区优于污灌区的特性。在沈阳张士灌区，迄今己有30多年的污水灌溉历史，由于灌溉水质不达标、污灌时间长，造成菜地土壤Cd,Hg的含量超标23。广州近郊因为污水灌溉而污染农田27.0 km2，因施用含污染物的底泥造成13.3km2的土壤被污染，每年因土壤污染而减产粮食1000万吨；另外还有1200万吨粮食中的污染物超标;两者的直接经济损失达200多亿元。尤其是城郊粮食、蔬菜、水果等食物，福、铬、砷、铅、铜等重金属超标严重，有的地区粮食含锡量甚至超过诱发“痛痛病” 24。20世纪70年代以来，北京市东南郊长期的污水灌溉已引起了土壤以及稻米、小麦等粮食作物中Cd等重金属元素的积累，局部地区蔬菜重金属含量超标25。据中国环境状况公报公布，在对3.0105 hm2基本农田保护区土壤中有害重金属抽样检测结果中，有3.6104 hm2土壤重金属超标，超标率达12.1%。上海地区农田重金属Cd属于轻度污染、中度污染和严重污染的农田面积分别为55.6103hm2，5.5103hm2和2.8103 hm2，分别研究区总面积的8.5%，0.8%和0.4%26。广东省地质勘查部门初步调查证实，在珠江口周边约l04 km2范围内，受人为污染导致部分土壤中多种有毒有害金属元素不同程度超标，以汞污染范围较大，污染深度达40cm。农田重金属污染不仅影响了食品的质量安全，并且会通过食物链危害到人类的健康。如发生在日本的“水俣病”和“骨痛病”事件，就是因为长期食用受Hg和Cd污染的食品所引起的。1.2土壤重金属污染的治理途径对于重金属污染的治理方法主要包括物理方法、化学方法和生物方法。目前，国内外治理重金属污染土壤的传统方法主要有基于机械物理或物理化学原理的工程措施，包括客土换土法、清洗法、热处理法、电化学法等；基于污染物土壤地球化学行为的改良措施，如加入改良剂以减轻污染物对生态环境的危害等27。传统修复方法的原理主要是通过减少土壤表层污染物的浓度，或增强土壤中的污染物的稳定性使其水溶性、扩散性和生物有效性降低，从而减轻其危害28。这些治理方法虽然治理效果较好，历时较短，但是往往有缺陷，如成本高，难于管理，易造成二次污染，对环境的扰动大。而对于广大的污染比较严重的发展中国家，它们的经济水平不高，这类技术的应用将受到限制。而生物修复有着物理修复、化学修复无可比拟的优越性：处理费用低，处理效果好，对环境的影响低，不会造成二次污染，操作简单，可以就地进行处理等29。生物修复已成为土壤修复领域研究的热点。1.3重金属污染的生物修复技术生物修复技术是近年来兴起的一种新的生态环境治理方法。生物修复是指在一定的条件下，利用微生物、植物和动物降解、稳定和去除环境中的污染物，使受污染生态系统的正常功能得以恢复。利用生物修复技术可以削弱乃至消除环境污染物的毒性，降低污染物的健康风险30。重金属污染土壤生物修复技术，是利用生物作用，削减、净化土壤中重金属或降低重金属毒性。该技术主要通过2种途径来达到净化作用31：通过生物作用改变重金属在土壤中的化学形态，使重金属固定或解毒，降低其在土壤环境中的移动性和生物可利用性；通过生物吸收、代谢达到对重金属的削减、净化与固定作用。在现阶段，生物固定技术在土壤重金属污染防治和保障农产品安全中的应用十分必要和有效。微生物可以转化、钝化和富集重金属，这一特征可用于减轻污染土壤中重金属污染物的毒害作用，减少植物对重金属的吸收。环境中重金属的加入，对微生物种类、活性产生影响的同时，微生物也通过自身的生命活动积极地改变着环境中重金属的存在状态。微生物可以通过改变土壤溶液pH、Eh、产生H2S和各种有机物等多种途径来影响重金属的化学行为。研究表明，一些微生物能够产生胞外聚合物，其主要成分是多聚糖、糖蛋白、脂多糖等，这些物质具有大量的阴离子基团，从而与重金属离子结合，成为重金属的有效生物吸附剂(biosorbents)。某些微生物能够代谢产生柠檬酸、草酸等物质，这些代谢产物能够与重金属产生螯合或形成草酸盐等沉淀，从而降低了土壤溶液中重金属的移动性和生物可利用性。此外，微生物菌体对重金属的吸附及吸收作用也减少了土壤溶液中可迁移的重金属浓度32。此外，生物提取技术利用能耐受并能积累金属的植物吸收环境中的金属离子，将它们输送并储存在植物体的地上部分，通过收割植物的上部从而达到清除土壤中重金属的目的。该方法主要用来处理土壤、底泥和污泥。广义的生物修复主要包括植物修复、动物修复和微生物修复，狭义的生物修复是指微生物修复。1.3.1土壤重金属污染的植物修复技术及其特点植物修复技术一般是指利用植物来清除土壤和水体中的污染物或降低污染物的毒性，使受到污染的环境得到恢复的一种技术方法33。植物修复技术具有利用太阳能、安全、成本低、生态协调及环境美化功能等特点，常常也被称之为绿色修复。植物修复逐渐通过实验确认其是一种有发展潜力的和有成本效益的技术34。植物对重金属污染土壤的修复主要基于以下几种机理：植物固定(Phytostabilization)，指利用植物根系的吸附作用或通过根系的分泌活动，使土壤中的重金属移动性降低，生物有效性下降，降低其迁移和生物毒性。在这一过程中，土壤中重金属含量并不减少，但形态发生了变化35。植物提取(Phytoextraction)，指利用特殊的植物吸收土壤中的重金属，也称为植物萃取。其基本策略在是在污染土壤上种植对污染重金属耐性强，吸收和富集量大的植物，利用植物根系吸收重金属并将其转移到地上部，通过连续地收获植物地上部，从而降低土壤中重金属的含量，达到土壤修复的目的。对于Cd污染土壤，植物提取修复是目前研究最多、也最具发展前景的植物修复方式之一。植物降解（Phytodegradation），指利用植物及其周围的相关微生物降解污染物。植物挥发（Phytovolatilization），指利用植物吸收土壤中的污染物并将其转化为气态物质释放到大气环境中，从而减轻土壤污染。主要是针对Se、Hg等挥发性金属。根系过滤（Rhizofiltration），通过生物和非生物的过程，将根际周围液体中的污染物吸附或沉积在根部表面，或者吸收转移到根的内部。1.3.2富集植物超富集植物超富集植物（Hyperaccumulator）的概念是Brooks等36在1977年首次提出来的。1983年Chaney提出了利用超富集植物治理土壤重金属污染的思想。超富集植物通常是指对重金属元素的吸收量超过一般植物100倍以上，并将其运移到地上部的植物。目前采用较多的是Baker和Brooks1983年提出的参考值，即把植物叶片或地上部(干重)中含Cd达到100 mg/kg，含Co,Cu,Ni,Pb达到1000 mg/kg，含Mn,Zn达到10 000 mg/kg以上的植物称为超富集植物。一般情况下重金属超富集植物的认定要考虑三个条件：植物地上部富集重金属的量要达到一定的临界标准，在较低的污染水平下也有较高的吸收速率；S/R1（S和R相应代表植物地上部分与地下部分的重金属含量），即植物应有较强的转运能力，而许多非超富集植物的S/R0.1；超富集植物能够忍耐较高浓度重金属的毒害，而一般植物则会发生毒害甚至死亡37。迄今为止，关于我国境内的重金属超积累植物资源的调查、鉴定和研究报道较少。已报道海洲香蕾(Elsholtzia splendens)是铜的超积累植物。陈同斌38等在国内首先发现As的超富集植物蜈蚣草(Pteris vittata)，以及最近新发现的As的另一种超富集植物大叶井口边草(Pteris nervosa) 39；薛生国40 等发现了Mn的超富集植物商陆(Phytoaccaacinosa)；杨肖娥41等发现的Zn的超富集植物东南景天(Sedum alfredii)；唐世荣42等相继报道了鸭跖草(Commelina communis Linn)是Cu的超富集植物。Cd超富集植物油菜43、宝山堇菜(Kola baoshanensis )44、龙葵45、和东南景天46；Pb的超富集植物土荆芥47；其中东南景天是Cd和Zn两种重金属的超富集植物。国外重金属超富集植物筛选工作开始较早，迄今为止，全世界现已发现的超富集植物有500多种，广泛地分布于植物界的45个科，其中Ni的超富集植物最多，达227种，还有一些Zn、Cu、Co、Mn、Cd等的超富集植物。这些超富集植物的分布较窄，最重要的超富集植物主要集中在十字花科。世界上研究得最多的超富集植物主要在芸苔属（Brassica）、庭芥属（Alyssums）及遏蓝菜属（Thlaspi）48。这些超富集植物大多是在气候温和的欧洲、美国、新西兰及澳大利亚的污染地区发现的。当前许多已发现和定论的超富集植物往往是质量分数大，植物植株矮小、生物量低、生长缓慢和生活周期长，这些植物在实际应用中能够去除土壤污染元素的总量较小，因而作为土壤修复植物，具有较小的经济和应用价值49。 很多学者研究发现印度芥菜(Brassica junica)是目前筛选出的一种生长快、生物量大的Cd超累积植物50，但印度芥菜有很强地域性，我国很难大面积种植，而印度芥菜所在的十字花科芸苔属植物中有很多种或基因型具有较强的吸收Cd特性。油菜(Brassica Chinensis L)作为印度芥菜同科属植物，在我国东北、西北、华东、华中、华南和西南地区均有大量栽培，是我国冬种主要油料作物之一，种植面积约占油料作物种植面积的1/3，总产量106t，种植面积和产量均居世界首位51。1.3.3超富集植物富集机理和耐性机制植物富集重金属的机理包括：细胞壁结合重金属。重金属沉淀于细胞壁，阻止重金属进入细胞原生质从而使其避免受到伤害；研究发现，Athyrium yokoscense 细胞壁中积累大量Cu，Zn和Cd，并占整个细胞总量的70%90%52。有机化合物的螯合作用。有机化合物包括有机酸、氨基酸、肌醇六磷酸盐、多肽金属硫蛋白和金属螯合肽等。重金属在植物体内与各种蛋白结合产生毒性，而有机化合物可与重金属离子形成较为稳定的螯合物，从而降低重金属的毒性。区域化分布。研究表明，在叶细胞运输中，组织和细胞水平上重金属在超富集植物的叶片中都存在区域化分布53。耐重金属植物能将过量金属储存在代谢不活跃的器官或亚细胞区域从而达到解毒的目的。植物对重金属耐性机制可以包括: 排斥作用，即重金属在植物体内的运输受到阻碍，被植物吸收后又被排斥出体外; 区域化作用，即重金属只在植物的某一特定部位富集，与细胞中其它组分隔离而达到解毒作用; 络合作用，指重金属与植物体内无机物(如硫化物)或有机物(如蛋白)形成络合物使重金属在液泡中聚集。1.3.4土壤重金属污染的微生物修复技术及其特点微生物修复是指利用天然存在的或所培养的功能微生物群，在适宜环境条件下，促进或强化微生物代谢功能，从而达到降低有毒污染物活性或降解成无毒物质的生物修复技术54。对微生物而言，这是一种很好的解毒作用；对环境而言，则是一种很好的修复作用。微生物在被污染土壤环境去毒方面具有独特作用已被用于进行土壤生物改成或土壤生物改良，高效微生物降解活性就地净化污染土壤55。土壤微生物是土壤中的活性胶体，它们比表面大、带电荷、代谢活动旺盛。受到重金属污染的土壤，往往富集多种耐重金属的真菌和细菌，微生物可通过多种作用方式影响土壤重金属的毒性。微生物对土壤中重金属活性的影响主要体现在以下4个方面：生物吸附和富集作用；溶解和沉淀作用；氧化还原作用；菌根真菌与土壤重金属的生物有效性关系。微生物对重金属污染土壤的生物修复作用主要是通过微生物对重金属的溶解、转化与固定来实现。微生物对重金属的溶解主要是通过各种代谢活动直接或间接进行的。土壤微生物通过代谢作用能产生多种低分子量的有机酸，如甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等。Siegel等报道,真菌可以通过分泌氨基酸、有机酸以及其他代谢产物来溶解重金属以及含重金属的矿物56。Chanmugathas等比较了不同碳源条件下微生物对重金属的溶解，发现以土壤有机质或土壤有机质加麦秆作为微生物的碳源时，微生物并不促进铅、镉、锌、铜等重金属的溶解；如果在加入土壤有机质、麦秆的同时还加入容易被微生物利用的葡萄糖，经过一段时间后，未灭菌处理的淋洗液中重金属离子的浓度明显高于灭菌处理的57。 一些微生物可对重金属进行生物转化，其主要机理是微生物通过氧化、还原、甲基化和脱甲基化作用转化重金属，改变其毒性。自养细菌如硫-铁杆微生物(Thiobacn1usfer robacillus)能氧化As、Cu、Mo、Fe等；假单孢杆菌(Pseudomonas)能氧化As、Fe、Mn等；微生物的氧化作用能降低这些重金属元素的活性。微生物可以通过对阴离子的氧化，释放与之结合的重金属离子。Cd2+的转化主要是假单胞菌属细菌的甲基化作用，Pb4+的转化主要是假单胞菌属和气单胞菌属的甲基化作用。 微生物对重金属的生物固定作用主要表现在胞外络合、胞外沉淀及胞内积累3种作用方式。由于微生物对重金属具有很强的亲合吸附性，有毒金属离子可以沉积在细胞的不同部位或结合到胞外基质上，或被轻度螯合在可溶性或不溶性生物多聚物上。一些微生物如动胶菌、蓝细菌、硫酸还原菌以及某些藻类，能够产生具有大量阴离子基团的胞外聚合物(如多糖、糖蛋白等)，与重金属离子形成络合物，从而将其从土壤中有效去除58,59。1.3.5微生物和植物的联合修复技术由于土壤环境的复杂性，用原有的物理、化学、植物及微生物等单一的方法对复合污染进行修复，都很难达到较好的效果，因此如何将各种修复技术进行合理的结合，真正在土壤污染修复方面取得突破性进展，成为现阶段的研究热点之一60。而微生物(细菌、真菌)-植物联合修复是土壤生物修复技术研究的新内容，具有良好的发展前景。联合修复技术的使用可以在一定程度上克服使用单一的修复手段存在的缺点，提高修复效率、降低修复成本60。微生物修复的局限性在于：微生物有些情况下不能将污染物全部去除；微生物对环境的变化响应比较强烈，环境条件的改变能大大影响微生物修复效果；加入到修复现场中的微生物可能会与土著菌株竞争或难以适应环境61。植物修复缓慢、对高浓度污染的耐受性低；超积累植物通常生物量低，生长比较慢，对金属有选择性，不适合多种重金属复合污染的治理，限制了植物修复技术在多种重金属污染土壤治理方面的应用。植物修复技术受到土壤中重金属的低生物有效性的限制62,63。在生物修复中，植物与微生物的联合修复展现出了良好的发展前景。盛下放等将从土壤中分离到3株具有很强的镉抗性细菌分别接种到添加镉(200mg/kg)的土壤并进行番茄盆栽试验，结果表明，供试抗性菌株均能显著促进植株生长，活化植物根际镉，接 RJ16菌株处理的番茄地上部植株干重、根际有效镉含量及植株吸收的镉含量分别比不接菌对照增加64.2%，46.3%，107.8%64。重金属污染土壤的植物-微生物联合修复的形式主要为：植物与专性菌株的联合修复和植物与菌根的联合修复。植物与专性菌株的联合修复是指在利用植物进行污染土壤修复的同时，向土壤中接种具有较强降解能力的专性降解菌，促进重金属污染物的降解。Ma等成功地从Ni污染土壤中分离得到耐受重金属污染的细菌，并发现这些细菌在较高水平重金属污染的土壤中能够促进植物生长。Whiting等利用锌的超积累植物结合植物根际细菌的应用，结果表明，重金属得到明显的活化，提高了植物对锌的富集65。植物与菌根的联合修复是指利用菌根能够有效降解污染物的特点，将其应用在环境修复中。所谓菌根就是土壤中真菌菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体。Dueck66等发现，泡囊丛枝菌根真菌(VAMF)侵染减轻锌对宿主的毒害，从而促进植物的生长和减少重金属进入食物链。廖继佩等67研究发现，将污泥施入土壤中结合接种优良菌根真菌措施能提高作物产量和增加对铜的吸收。1.4土壤重金属Cd对植物的影响Cd是危害植物生长发育的有害元素，土壤中过量 Cd会对植物生长发育产生明显的危害。土壤中Cd胁迫对植物代谢的影响更加显著，胁迫引起植物体内活性氧自由基剧增，超出了活性氧清除酶的岐化-清除能力时，使根系代谢酶活性降低，严重影响根系活力68。Cd、 Pb 处理可使叶绿体结构发生明显变化，破坏了叶绿体的膜系统69。Cd会降低叶绿素含量，使叶片发黄，严重时几乎所有叶片都出现褪绿现象，叶脉组织成酱紫色、变脆、萎缩、叶绿素严重缺乏，表现为缺铁症状70。研究发现，在铅、 镉复合污染条件下，烟叶硝酸还原酶、 过氧化氢酶显著下降71。罗立新等72研究发现，镉胁迫使植物体内活性氧自由基清除系统的功能降低，造成细胞内 H2O2 积累，抗坏血酸过氧化酶和谷胱甘肽还原酶活性下降，内源抗氧化剂抗坏血酸和谷胱甘肽含量减少，小麦叶片的组织自动氧化速率显著提高。张现勇等73从油菜根中分离得到一株的菌株yc8，其促进了植物生长及其营养代谢，提高了油菜品种叶绿素、可溶性蛋白、可溶性糖。2.材料与方法2.1供试作物和土壤供试土壤采自保定市郊污灌区（020 cm）。土壤基本性质如下：土壤pH 8.4，有机质含量 19.04 gkg-1，全氮0.79 gkg-1，碱解氮81.35 mgkg-1，全磷0.83 gkg-1，全Cd 3.1 mgkg-1。供试植物为青帮油菜，购于保定市农资科技市场。2.2供试菌株筛选及鉴定培养基：单菌落分离培养基（NA培养基）：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH7.27.4；富集培养基（NA培养基）：同上；筛选培养基：NA或NB培养基+新配制的酚红试液；种子培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2-7.4；发酵培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.27.4。筛选菌种所用土壤：安新县北际头乡，保定纳污河府河末梢入淀口处的底泥，其有效态Cd、Pb、Zn含量分别为1.70、16.80、61.50 mgkg-1。将污染土壤按梯度稀释法将制备的菌悬液涂布在固体培养基表面，30培养3d，待长出菌落后选择生长丰满的单菌落进行划线纯化直至出现单菌落，获得纯培养，将分离出的细菌于4保存于斜面培养基上备用。在NA培养基中加入新配制的酚红试剂，用划十字法接种微生物后，在菌落周围出现淡黄色颜色圈，则表示微生物在代谢过程中产生了能使酚红变色的物质，则表示该微生物有产酸能力。经过初步筛选共得到60株产酸菌，将初筛中产酸较好，产生颜色圈较好的试管斜面菌株挑选出来，同液体发酵的方法对挑选出的菌株再次进行筛选，保留效果更好的试管斜面菌株。复筛后挑选29株活性较强的挑取斜面保存。经过生长速度的比较，从中挑选出 4株生长速度快，镉抗性稳定的菌株，JA1、JA2、JA3和JA4。根据微生物常用鉴定方法对筛选出来的菌株进行鉴定74。2.3试验设计盆栽试验在河北农业大学西校区标本园大棚内进行，用上、下口内径分别为21 cm，14 cm，高 15 cm的塑料桶作盆，盛过3 mm筛的风干土，每盆装土3. 0 kg，同时每盆施入 0.99 g尿素和 1.20 g（NH4）2HPO4做底肥。底肥和土壤混匀装盆，在60%田间持水量下平衡30d后播入油菜种子，生长一周后间苗，每盆定苗8株。油菜生长20 d进行微生物接种处理，分别接种JA1、JA2、JA3和JA4，4种菌剂，且每种菌剂分别设7102，7103，7104，7105，7106 CFUg-1 5个浓度，共计20个处理，每个处理设3次重复。每种菌剂的施入量为200mL，分两次施入。同时设浇入200 ml 灭活菌培养基的对照处理（CK）。生长过程中根据植物生长需求用蒸馏水浇灌，60 d 后收获取样。表1 各处理接种菌液的种类、浓度及处理号 （浓度单位：CFUmL-1）浓度菌株71027103710471057106JA1（A）A1A2A3A4A5JA2（B）B1B2B3B4B5JA3（C）C1C2C3C4C5JA4（D）D1D2D3D4D52.4 样品采集与分析方法2.4.1植物和土壤样品的采集植物样品的采集：收获时沿土面剪取地上部，测量株高、鲜重，同时洗出根系，地上部和根系分别用蒸馏水冲洗干净，再用去离子水冲洗，然后植物样品在105条件下，杀青30 min，后在70条件下烘至恒重。烘干样品全部粉碎、混匀并装袋备用。土壤样品的采集：收获后，盆栽试验中采用五点法取适量土样，风干后过1mm和0.15mm筛备用。2.4.2 植物样品中镉含量的测定油菜中Cd含量采用湿法(HNO3-HClO4)消解，用岛津AA-6300型石墨炉原子吸收光谱仪（AAS）测定Cd含量。2.4.3土壤中全量镉和有效态镉含量的测定土壤中全量镉的测定：土壤重金属元素全量Cd分析用王水+高氯酸消化分析。土壤中有效态镉含量的测定：采用DTPA浸提（0.005 mol/L DTPA+0.01 mol/L CaCl2+0.1 mol/L TEA，二乙基三胺五乙酸）原子吸收法测定土壤中有效态Cd含量。称取过1mm筛的风干土壤25.00g放入100ml塑料瓶中，加入DTPA提取剂50ml，在室温下（252）以18020次/min的速率振荡2h取下，过滤取得清液，用岛津AA-6300型石墨炉原子吸收光谱仪（AAS）测定Cd含量。2.4.4其它指标的测定用pH计测定土壤pH(1:2.5土水比)。叶绿素采用手持叶绿素测定仪（SPAD-502）测定；油菜可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-250染色法；维生素C总量的测定采用2,4-二硝基苯肼比色法。2.5数据处理所列结果均为3次重复的平均值，数据处理采用 SPSS11. 5 统计软件进行Duncan差异显著性分析。3.结果与分析3.1 供试菌株的鉴定 通过对4株菌菌落形态的观察，初步判断均为细菌菌落，形状为圆形或近圆形、表面湿润不透明。试验菌株经革兰氏染色后在显微镜下观察，该4种菌株均呈杆状，革兰氏染色呈阳性。对照常见细菌鉴定手册，经形态学特征分析初步鉴定4菌株为反硝化利斯特氏菌Listeria denitrificans (JA1)，环状芽孢杆菌Bacillus cirallans（JA2），干燥奈瑟氏球菌Neisseria sicca（JA3），格氏利斯特氏菌Listeria grayi（JA4）。3.2微生物处理对油菜生长发育和生物量的影响3.2.1不同菌液对油菜生长发育和生物量的影响表2微生物对油菜生长发育的影响Tab1. Effects of microorganism on growth of rape处理Treatment生物量Biomass（gpot-1 F W）平均株高Average height(cm)长势情况 Growing conditionCK174.10.06a19.250.37a植株正常生长203.91.22c22.892.21b生长良好 224.71.84e25.851.27b长势旺盛，植株高大211.72.94d21.350.88b长势一般 193.22.77 b24.811.33bc长势一般在接种菌液后，各处理油菜都能顺利发芽正常生长，均无明显受毒害现象。处理A中植株生长良好。处理B中植株生长旺盛，株高有显著提高，茎叶大小要高于CK。处理C与处理D中植物长势一般，未出现叶黄、植株细弱、萎蔫等不良现象。生物量是反映植株生长的最重要的指标。表2为A、B、C、D和CK处理五个浓度梯度下油菜平均总鲜重及株高。从对油菜生长情况的表观观察结果来看，A，B，C，D处理下油菜平均生物量和平均株高均大于对照处理，说明接种菌液没有影响植株正常的生长发育，并且其对植株的生长有促进作用。A，B，C，D各处理之间差异显著。与CK相比，各处理油菜生物量显著增加，分别提高了17.1 %，29.1%，21.6%，10.9%。其中B处理在各处理中油菜长势最为旺盛，植株高大，其生物量达到224.7gpot-1，株高达到25.85cm，可能是由于JA2菌株能够活化土壤矿物中的P、K等植物营养元素，促进了植物的生长。处理A和D油菜的平均生物量均较低。可见，供试土壤Cd浓度为3.1mg/kg，虽超出土壤环境质量标准GB 15618-1995三级标准，但各处理植株均未表现出明显的受害症状。说明在Cd浓度为3.1mgkg-1的条件下，接种菌液后对油菜生长没有不良影响，而有促进作用。3.2.2微生物处理浓度对油菜生物量的影响如图1所示，各处理的生物量并不是随着菌液浓度的增加而递增。处理A的生物量为190.2196.4 gpot-1，较CK提高了9.2%12.8%；处理B的生物量为210.4219.5 gpot-1，较CK提高了20.8 %26.1%。处理A和B的生物量均随菌液浓度的升高出现先增后减的趋势，图1微生物处理浓度对油菜生物量的影响并且均在浓度为7104时出现最大值。处理D的生物量为176.9191.3 gpot-1，其生物量随菌液浓度的升高出现先增后减的趋势，在浓度为7103时出现最大值191.3 gpot-1。处理C的生物量为190.2196.4 gpot-1，随菌液浓度的增加呈现出递减的趋势。由此可以看出，四种微生物菌液的浓度对植株生长均有一定的影响，A，B，D三种处理均呈现先增后减的趋势，而处理C呈现出递减的趋势。处理间差异性可能与菌液的种类有关。3.3微生物处理对油菜Cd富集量的影响3.3.1微生物处理对油菜地上部Cd富集量的影响表3土壤重金属有效态含量和油菜的Cd富集量Table 3Contents ofavailable heavymetals in the soil and Cd uptake by rape(mgkg-1DW )处理土壤有效态含量地上部富集量根系富集量CK0.810.032b4.130.02b8.30.01b1.020.010c5.200.21c10.690.28bc1.290.028e5.660.11c11.430.95d0.700.025a3.270.18a6.860.91a 1.150.040d6.300.25d10.960.53bc图2微生物A处理下油菜的地上部和根系富集量图3 微生物B处理下油菜的地上部和根系富集量图4 微生物C处理下油菜的地上部和根系富集量图5 微生物D处理下油菜的地上部和根系富集量4种微生物菌液处理下，油菜地上部及根系Cd富集量平均值见表3。由表3可以看出，A、B、D处理的地上部富集量均值均大于CK，而C处理的地上部富集量小于对照。4种处理对Cd的地上部富集量的均值大小为DBACCK。由图2可以看出，A处理下，地上部Cd富集量为4.525.58 mgkg-1，较对照提高10.2%36.1%，说明施入JA1菌液对油菜富集Cd有一定的促进作用，提高了油菜地上部富集Cd的含量。A处理下，油菜地上部Cd富集量随菌液浓度的增加呈现出先升高再降低的趋势，A3处理浓度下到达最大值5.58mgkg-1，较对照提高了36.1%。说明7104 CFUmL-1为菌液JA1的最适浓度。微生物处理浓度由7102 CFUmL-1到7104 CFUmL-1的变化过程中，Cd的地上部富集量升高得较快，而浓度由7104 CFUmL-1到7106 CFUmL-1的变化过程中，Cd的地上部富集量降低的幅度较小，趋于平缓。可能是由于当微生物菌液浓度为7104 CFUmL-1时，土壤温度及养分状况适宜微生物产酸，从而提高了油菜的地上部富集量。由图3可知，B处理下，地上部Cd富集量为5.406.06 mgkg-1，较对照提高了32%48%，均值为5.66 mgkg-1。各浓度下，地上部Cd富集量的变化趋势与A处理相同，也是呈现先增大后减小的趋势。说明菌液浓度在7104 CFUmL-1时，达到了富集Cd的最佳浓度，当其浓度再升高时，油菜对Cd的富集量稍有降低，但变化不大。由图4可知，C处理的地上部Cd富集量为2.93.81mgkg-1，较对照降低了7%29%，均值为3.27 mgkg-1。C处理地上部Cd富集量有所减少，说明其对土壤中重金属Cd产生了钝化作用，使植物难以吸收，由于添加微生物之后降低了植物中Cd的浓度，从而减小了重金属Cd对油菜的毒害作用。由图5可知，D处理下，地上部Cd富集量为5.606.80 mgkg-1，较对照提高了37%63%，均值为6.30 mgkg-1。D处理下，油菜地上部富集量随菌液浓度的增加而增加。说明油菜地上部富集量与微生物菌液JA4的浓度密切相关。由此可知，A、B、D处理各自地上部富集量的变化基本上是相似的，都是随着菌液浓度的增加，先增加后减小；而C处理地上部富集量变化趋势是随着菌液浓度的增加，先降低后增加。A、B、D三个处理均增大了油菜对Cd的富集量，这是由于3种产酸菌产生的低分子量有机酸活化了土壤中的重金属，从而促进了油菜对其的吸收。而C处理降低了油菜对Cd的富集，说明其对Cd浓度为3.1mgkg-1的污染土壤具有一定的原位修复效果。3.3.2微生物处理对油菜根系Cd富集量的影响A处理的根系富集量为9.7711.42mgkg-1，均值为5.18 mgkg-1，均大于对照处理，并且较对照提高了7.5%25.6%；同时是其相应的地上部富集量的1.752.34倍。随着油菜地上部富集量的增加，根系富集量却并没有随之增加，而是呈减小的趋势，即地下部富集量的变化趋势与地上部富集量的变化成反比。且油菜根系吸收的Cd向地上部转运的能力在菌液JA1的浓度为7104 CFUmL-1时最强。这可能是由于微生物产生低分子有机酸，活化难溶态的重金属Cd之后，地上部与根系富集Cd之和处于一种平衡态。B处理的根系富集量为 8.3713.42mgkg-1，B1B4处理较对照提高了12%48%，B5处理根系富集量有所减少，较对照减少了8%；是其相应的地上部富集量的1.55 2.41倍，且根系富集量随着微生物菌液浓度的增加而降低。这说明微生物菌株JA2的浓度提高，有助于土壤中的Cd向地上部转移。