生物化学第34章ppt课件

第34章DNA的复制和修复 DNAreplicationandrepair 一 DNA的复制二 DNA的损伤修复三 DNA的突变 一 DNA的复制 一 DNA的半保留复制 DNA复制的三种可能模式 ConservativeSemiconservativedispersive Afteronegeneration Aftertwogenerations Watson和Crick提出的DNA双螺旋复制模型 old new DNA的半保留复制 原来的亲代分子 第一代子分子 第二代子分子 DNA半保留复制的实验证明 1958年 Meselson和Stahl利用15N标记大肠杆菌DNA的实验 首先证明了DNA的半保留复制 他们让大肠杆菌在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长 经过连续培养12代 使所有的DNA分子都标记上15N 15N DNA的密度比普通14N DNA大 在氯化铯密度梯度离心时可以区分这两种DNA DNA半保留复制的实验证明 这时将大肠杆菌转移到普通培养基 含14N 上培养 经过一代以后 所有DNA的密度都介于15N DNA和14N DNA之间 说明其为14N和15N的杂合分子 两代后 14N分子和杂合分子等量出现 当把杂合分子加热 使它们分开成单链再离心 可见有一半与单链15N DNA的密度相同 另一半与单链14N DNA的密度相同 二 DNA复制的起点和方式 DNA上能独立进行复制的单位称为复制子 replicon 每个复制子都有复制起始点 可能还有复制的终点 DNA复制起始点一般有特定的序列 DNA在复制起始点处解开双链 形成一个复制泡 也叫复制眼 有些DNA的复制从复制起始点开始向两边复制 也有些DNA的复制从复制起始点开始向一边复制 它们分别称为双向复制和单向复制 DNA复制的方向 未复制DNA 单向复制 双向复制 中国仓鼠卵巢细胞DNA复制的电镜照片 大箭头所指为复制泡 小箭头所指为复制叉处的单链部分 注意二者在相反的链上 各种生物DNA的结构 DNA有线性双链和环状双链 也有环状单链的 原核生物的染色体DNA和质粒 以及真核细胞中的线粒体和叶绿体DNA都是双链环状的 真核生物的染色体DNA是双链线性的 病毒的DNA有单链环状的 也有双链环状的 还有双链线性的 DNA上复制子的数目 原核生物染色体DNA和质粒DNA就是一个复制子 从一个复制起始点开始完成整个DNA分子的复制 真核细胞一个染色体DNA上有许多复制子 许多复制起始点同时开始复制 每一个复制起始点完成一段DNA的复制 然后将各个片段连接起来 复制起始点的确定 大肠杆菌染色体DNA只有一个复制起始点 在一个生长的群体中几乎所有的染色体都在复制过程中 因此离复制起始点越近的基因拷贝数就越多 也就是出现的频率越高 将从大肠杆菌中提取出来的DNA切成大约1 染色体长度的片段 通过分子杂交的方法测定各基因片段的频率 结果表明复制起始点oriC位于基因图谱的ilv位点处 83分附近 一旦复制开始 复制叉向两侧以相等的速度向前移动 两个复制叉在离起始点180 的trp位点处 33分附近 相会合 大肠杆菌染色体DNA复制起始点的确定 DNA的复制方式 直线双向 多起点双向 型双向 型单向 DNA的复制方式 D环 线粒体DNA的复制采取这种方式 DNA的复制方式 2D环 DNA的复制方式 滚动环 大肠杆菌的多复制叉染色体 DNA酶促合成的引物链和模板链 三 DNA聚合反应有关的酶 DNA聚合酶催化的聚合反应 DNA聚合酶的反应特点 以4种dNTP作底物 反应需要接受模板的指导 反应需要有引物3 羟基存在 DNA链的延长方向为5 3 产物DNA的性质与模板相同 大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌有5种DNA聚合酶 分别称为DNA聚合酶 和 它们有各自不同的用途 大肠杆菌DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 由一条肽链 928个氨基酸残基 组成 含有一个锌原子 分子量109kD 它是一个多功能酶 具有以下活性 5 3 聚合活性 3 5 外切活性 校对活性 5 3 外切活性 只作用于双链DNA 从3 端使DNA链发生焦磷酸解 聚合反应的逆反应 无机焦磷酸盐与dNTP之间的焦磷酸基交换 大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow片段 用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的大肠杆菌DNA聚合酶 得到C端324 928氨基酸残基的片段 称为Klenow片段 1 323氨基酸残基为小片段 小片段具有5 3 外切活性 Klenow片段具有聚合酶活性和3 5 外切活性 酶切位点 Klenow片段的立体结构 蓝色为模板链 红色为引物链 Klenow片段的活性位点 DNA聚合酶 的校对作用 在正常聚合条件下 3 5 外切活性不能作用于生长链 一旦出现错配碱基时 聚合反应立即停止 生长链的3 末端核苷酸落入3 5 外切活性位点 错配核苷酸被迅速切去 然后继续进行聚合反应 3 5 外切活性起着校对的作用 校对作用越强 DNA复制的准确性越高 适当的错配有利于发生突变 有利于物种的进化 突变率太高也不利于保持物种的稳定性 DNA聚合酶 的切口平移作用 关于大肠杆菌DNA聚合酶的研究 根据对各种DNA聚合酶在大肠杆菌细胞中的活性 合成DNA的速度 该酶基因突变对DNA复制的影响的研究 发现DNA聚合酶 是大肠杆菌细胞中DNA复制的主酶 而DNA聚合酶 和 的功能只是参与DNA损伤的修复 大肠杆菌中3种DNA聚合酶性质的比较 大肠杆菌DNA聚合酶 DNA聚合酶 全酶的结构 与 结合 两个 亚基各催化复制叉处一条链的合成 二聚体的滑动夹子结构 红 黄绿色各为一个 亚基 DNA聚合酶 和 DNA聚合酶 和 是在1999年才被发现的 它们的功能是进行易错修复 DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶可以连接切口和粘性末端 T4噬菌体DNA连接酶除可以连接切口和粘性末端外 还可以连接平末端 DNA的连接类型 四 DNA的半不连续复制 在复制叉处 两条新生链是同时合成的 新生链延伸的方向一条是5 3 而另一条是3 5 这就不符合DNA聚合酶催化反应的性质 为了解决这个矛盾 日本学者冈崎等提出了DNA的不连续复制模型 认为3 5 走向的新生DNA链实际上是由许多5 3 方向合成的片段连接起来的 DNA复制叉处的前导链和滞后链 5 3 链是连续合成的 3 5 链是不连续合成的 因此称为半不连续复制 冈崎片段的发现 1968年 冈崎等用3H 脱氧胸苷标记噬菌体T4感染的大肠杆菌 然后通过碱性密度梯度离心法分离标记的DNA产物 发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段 接着出现较大的分子 最初出现的DNA片段的长度约为1000个核苷酸左右 这种片段称为冈崎片段 Okazakifragment 用DNA连接酶变异的温度敏感株进行实验 在连接酶不起作用的温度下 有大量DNA片段积累 这些实验都说明在DNA复制的过程中 首先合成较短的片段 然后再由连接酶连接成大分子DNA 原核生物和真核生物的冈崎片段 细菌的冈崎片段长度为1000 2000个核苷酸 相当于一个顺反子 cistron 的长度 真核生物的冈崎片段长度为100 200个核苷酸 相当于一个核小体DNA的长度 DNA复制中的引物 由于DNA聚合酶必须在已有的核酸链的3 羟基上延伸新链 所以在前导链合成开始时以及滞后链的每一个冈崎片段开始时都需要有引物 RNA聚合酶以DNA为模板合成RNA的过程称为转录 转录是不需要引物的 DNA复制的引物就是小片段的RNA 这个RNA引物的合成是由引物合成酶催化合成的 RNA引物的长度通常为几个核苷酸至十几个核苷酸 六 DNA复制的过程 DNA复制叉处的结构 DNAligaseDNApolymerase OldOkazakifragment Okazakifragment Primer Laggingstrandtemplate Primer Helicase primase Newlysynthesizedleadingstrand DimericreplicativeDNApolymerase subunit slidingclamp SSB Leadingstrandtemplate DNAgyrase 大肠杆菌染色体oriC的结构 DNA复制的起始 DNA复制的起始 DNA复制的起始 DnaB有解旋酶活性 它每解开一个碱基对需要消耗2个ATP DNA复制体的装配 DNA复制体的装配 DNA复制体的装配 DNA复制叉的延伸 Leadingstrand core DNApolymerase SSB 2 Repprotein Helicase Primosome 3rdRNAprimer Laggingstrand core DNApolymerase 1stRNAprimer 2ndRNAprimer GrowingOkazakifragment DNA复制的终止 Tus蛋白与Ter位点结合后起终止复制叉前进的作用 连锁体 拓扑异构酶 拓扑异构酶可以改变DNA双螺旋的连环数 其功能是引入超螺旋或解开超螺旋 拓扑异构酶可分为两类 类型 的酶能使DNA的一条链发生断裂和再连接 反应无需提供能量 类型 的酶能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接 当它引入超螺旋时需要由ATP提供能量 拓扑异构酶 拓扑异构酶 属于类型 它只能消除负超螺旋 对正超螺旋不起作用 拓扑异构酶在使DNA的一条链断裂时 由于酶与DNA结合 DNA链不能自由转动 超螺旋的扭曲张力不会自动消失 但是酶分子可牵引另一条链通过切口 然后使断链重新连接起来 从而改变DNA的连环数和超螺旋数 拓扑异构酶 拓扑异构酶 属于类型 又叫旋转酶 gyrase 它可连续引入负超螺旋 反应需要消耗ATP 在无ATP存在时 它可以松弛负超螺旋 但不作用于正超螺旋 大肠杆菌旋转酶由两个A亚基和两个B亚基组成 A亚基是抗萘啶酮酸和奥啉酸的作用位点 B亚基是抗香豆霉素A1和新生霉素的作用位点 这些抗生素均能抑制DNA复制 因而推测旋转酶对DNA复制是必需的 旋转酶的作用机制 解旋酶 解旋酶能将DNA两条链解开 每解开一对碱基 需要水解2分子ATP 大肠杆菌有许多种解旋酶 其中解旋酶 可以沿着模板链的5 3 方向移动 而rep蛋白则沿着3 5 方向移动 过去认为在DNA复制中 这两种酶配合作用解开DNA双链 但上述酶经诱变并不影响DNA的复制 DnaB蛋白 曾经分离出一些大肠杆菌DNA复制的温度敏感突变株 其中一株当培养温度由30 升高到40 时 DNA复制立即停止 分析表明dnaB基因发生了温度敏感突变 该基因产物DnaB是一种解旋酶 可沿DNA链5 3 方向移动 由ATP提供能量 这就证明该解旋酶参与DNA的复制 单链结合蛋白 大肠杆菌的单链结合蛋白 SSB 由4个相同的亚基组成 它的功能是与已经解开的单链DNA结合 阻止重新形成双链 保护单链部分不被核酸酶降解 原核生物的SSB蛋白与单链DNA的结合有正协同效应 当第一个SSB蛋白结合后 后面的SSB蛋白的结合力可提高103倍 因此一旦结合反应开始 全部单链DNA迅速被SSB覆盖 但真核生物的SSB蛋白没有这种协同作用 七 真核生物DNA的复制 真核生物染色体有多个复制起始点 5 氟脱氧尿苷是细胞内胸腺嘧啶核苷酸合成的抑制剂 用5 氟脱氧尿苷处理真核生物的培养细胞可以抑制DNA复制 随后加入3H 脱氧胸苷就可以使DNA复制同步化 复制进行大约30分钟 然后制成DNA的放射自显影图像 在电子显微镜下观察 可以看到很多复制眼 每个复制眼都有独立的起点 并呈双向延伸 通过测量和换算 可以估算出复制子的大小 真核生物的复制子 哺乳动物的复制子大多在100 200kb之间 人的细胞有23对染色体 单倍体基因组大约有3 109bp 平均每个染色体有1000个复制子 果蝇或酵母的复制子较小 平均为40kb 真核DNA的复制速度 真核生物DNA的复制速度比原核生物慢 大肠杆菌DNA复制叉的移动速度为50 000bp min 哺乳类动物复制叉的移动速度仅为1000 3000bp min 但因真核细胞染色体有许多复制起始点同时起始复制 所以总的复制速度并不慢 哺乳动物的DNA聚合酶 细菌和真核生物复制体的组成 PNCA同源三聚体夹子 真核染色体末端的复制 对于线性DNA的复制 两条新链5 末端的引物切除后出现缩短现象 这种现象会使染色体不稳定 为了解决这个问题 染色体的两端有一段特殊序列 称为端粒 它由许多短序列的串联重复组成 原生动物四膜虫端粒的重复序列为TTGGGG 人的端粒重复序列为TTAGGG TG链常比其互补链更长 形成3 突出末端 端粒可防止染色体间末端连接 并可补偿滞后链5 末端在消除RNA引物后造成的短缺 端粒酶 端粒酶是一种含有RNA的逆转录酶 它以所含的RNA为模板来合成DNA的端粒结构 以延长缩短了的端粒 四膜虫端粒酶的RNA为159个碱基 含有CAACCCCAA序列 端粒酶可结合到染色体端粒的3 末端上 RNA模板的5 末端识别DNA的3 末端碱基并与之配对 并在3 末端的羟基上延伸合成新的重复序列 合成1个重复单位后酶再向前移动一个重复单位 端粒的3 末端又可回折作为引物 合成其互补链 新生链5 端的短缺和端粒酶延长端粒的功能 真核染色体端粒的延长 细胞的寿命与端粒的关系 在动物的生殖细胞中 由于端粒酶的存在 端粒一直保持着一定的长度 体细胞随着分化而失去端粒酶活性 在缺乏端粒酶活性时 细胞连续分裂使得端粒不断缩短 短到一定程度即引起细胞生长停止或凋亡 实验表明 经过多代培养的细胞其染色体的端粒变短 染色体也变得不稳定 但在肿瘤细胞中却有端粒酶活性 二 DNA的损伤修复 尽管DNA聚合酶有校对功能 DNA在复制过程中 仍可能产生错配 其他内因外因也会造成DNA的损伤 如紫外线照射 电离辐射 化学诱变剂 病毒DNA的整合 DNA重组等 DNA损伤会引起生物突变 甚至导致死亡 在一定的条件下 生物机体能使其DNA的损伤得到修复 这种修复是生物在长期进化过程中获得的一种保护功能 DNA损伤修复的种类 目前已经知道 细胞对DNA损伤的修复系统有5种 错配修复 mismatchrepair 直接修复 directrepair 切除修复 excisionrepair 重组修复 recombinationrepair 易错修复 error pronerepair 一 错配修复 DNA在复制过程中发生错配 如果新合成的链被校正 基因编码的信息可得到恢复 但是如果模板链被校正 突变就被固定 细胞错配修复系统能够区分 旧链 和 新链 Bam甲基化酶可使DNA的GATC序列中的腺嘌呤N6位甲基化 复制后DNA在短期内 数分钟 为半甲基化的GATC序列 一旦发现错配碱基 即将未甲基化的新链切除 并以甲基化的旧链为模板进行修复合成 错配修复 在大肠杆菌中 MutS二聚体识别并结合到DNA的错配碱基部位 MutL与MutS结合 二者组成的复合物可沿着DNA双链向两个方向移动 DNA由此形成突环 复合物的移动需要水解ATP提供能量 当遇到GATC序列时 MutH核酸内切酶结合到MutSL上 并在未甲基化的新链GATC的5 端切断 错配修复 错配修复 如果切开处位于错配碱基的3 侧 由核酸外切酶 或核酸外切酶 沿3 5 方向切除核酸链 如果切开处位于错配碱基的5 侧 则由核酸外切酶 或RecJ沿5 3 方向切除核酸链 在此切除过程中 解旋酶和SSB帮助链的解开 切除的链可长达1000个核苷酸以上 直到将错配碱基切除 新的DNA链由DNA聚合酶 和DNA连接酶合成并连接 二 直接修复 紫外线照射可以使DNA分子中同一条链上相邻的两个胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体 其它嘧啶碱基之间也能形成类似的二聚体 但数量较少 嘧啶二聚体的形成 影响了DNA的双螺旋结构 使其复制和转录功能均受到阻碍 嘧啶二聚体的光复活 直接解开嘧啶二聚体 O6 甲基鸟嘌呤的修复 O6 甲基化的鸟嘌呤在O6 甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶作用下 可将甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上 甲基转移酶因此而失活 但却成为其自身基因和另一些修复酶基因转录的活化物 促进它们表达 三 切除修复 切除修复就是在一系列酶的作用下 将DNA分子中受损伤的部分切掉 然后以完整链为模板 合成出切掉的部分 使DNA恢复正常的过程 一些糖苷酶能够识别错误的碱基 将这些碱基水解 使得这些部位无碱基 称为AP位点 一旦AP位点形成 即有AP核酸内切酶在AP位点附近将DNA链切开 然后核酸外切酶将包括AP位点在内的一段DNA链切掉 DNA聚合酶 和DNA连接酶补上缺口 另一种切除修复是利用切除酶在损伤部位的两侧切开 除去错误片段 再合成出正确的序列 切除修复 碱基缺陷或错配结构缺陷 切掉错误碱基N 糖苷酶切开核酸内切酶 切开核酸内切酶 切开AP核酸内切酶 修复DNA聚合酶 连接DNA连