人类细胞质RNA提取、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用.ppt

2020 3 7 RNA 2020 3 7 人类细胞质RNA提取 RT PCR的原理 方法 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 主要内容 人类细胞质RNA提取 2020 3 7 电泳 PCR 提取总RNA 合成cDNA第一链 2020 3 7 真核细胞RNA的种类 真核细胞总RNA主要由rRNA 80 85 tRNA和核内小分子RNA 10 15 mRNA 1 5 组成 其中rRNA tRNA和mRNA位于细胞质中 大多数真核细胞mRNA在其3 端均有一多聚A PolyA 尾巴 2020 3 7 实验前的准备 RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染 由于RNA酶广泛存在而稳定 可耐受多种处理而不被灭活 如煮沸 高压灭菌等 只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解 而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果 所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要 2020 3 7 常用的RNA酶抑制剂 1 焦磷酸二乙酯 DEPC 与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合 进而使RNA酶失活 有高致癌性 实验准备阶段使用 2 异硫氰酸胍 氯仿 提取RNA同时也使RNA酶失活 3 RNA酶的蛋白抑制剂 RNasin 从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白 合成cDNA阶段使用 2020 3 7 实验原理 Trizol试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍 GTC 的混合物 异硫氰酸胍可裂解细胞 促使核蛋白体的解离 使RNA与蛋白质分离 加入氯仿可抽提酸性的苯酚 而酸性苯酚促使RNA进入水相 离心后 RNA保留在水相中 DNA和蛋白质保留在有机相中 转移水相 加入异丙醇沉淀RNA 从而得到纯化的总RNA 2020 3 7 提取RNA 一 准备试剂 氯仿异丙醇75 乙醇无RNase的水或0 5 SDS 溶液均需用DEPC处理过的水配制 2020 3 7 提取RNA 二 操作步骤 取材 用生理盐水漱口后 含生理盐水约2 3min 用15ml离心管 4000rpm5min 收集细胞 同管多次离心 弃上清沉淀中加入1mlTRIzol 旋涡震荡10s重悬沉淀 加样枪打匀溶液后转移至1 5mlEP管 15 30 放置5min加入0 2ml氯仿 用手摇晃15s 15 30 放置5min12000rpm离心15min 2020 3 7 提取RNA 二 操作步骤 小心吸取上清 转移至新的1 5mlEp管 加入等体积的异丙醇 15 30 放置10min12000rpm离心15min 小心去上清 加入1ml70 乙醇 震荡数秒 8000rpm离心5min小心去上清 室温干燥5min 加入10ulDEPC水 打匀55 水浴10分钟助溶 2020 3 7 提取RNA 三 注意事项 1 塑料器皿可用0 1 DEPC水浸泡12h以上 高压灭菌 2 有机玻璃的电泳槽等 可先用去污剂洗涤 双蒸水冲洗 乙醇干燥 再浸泡在3 H2O2室温10min 然后用0 1 DEPC水冲洗 晾干 3 所有的玻璃器皿均应在使用前于180 的高温下干烤6h或更长时间 4 配制的溶液应尽可能用0 1 DEPC在37 处理12h以上 然后用高压灭菌除去残留的DEPC 不能高压灭菌的试剂 应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制 然后经滤膜过滤除菌 5 操作人员戴一次性口罩 帽子 手套 实验过程中手套要勤换 2020 3 7 提取RNA 三 注意事项 6 设置RNA操作专用实验室 所有器械等应为专用 7 防止RNA酶污染 1 RNA酶可耐受多种处理而不被灭活 如煮沸 高压灭菌等 2 严格控制外源性RNA酶的污染 外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗 唾液等 也可存在于灰尘中 造成器械 玻璃制品 塑料制品 电泳槽 研究人员的手及各种试剂的污染 3 最大限度地抑制内源性的RNA酶 而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶 2020 3 7 RNA保存 溶解在无RNase的水或TE中 在 70 或更低温度中保存时间在一年以内 但避免反复冻融 应分装保存 从富含RNase的样品 如胰脏 肝脏 中分离到的RNA需溶解在去离子甲酰胺中存于 70 至少可以保存一年 需使用RNA时 可以加入NaAc至终浓度0 3M 12000 g离心5分钟 70 乙醇洗涤后再用无RNase的水或TE溶解 RT PCR的原理 方法 2020 3 7 实验原理 1 单拷贝基因表达存在逐步放大机制 2 PCR技术 即聚合酶链式反应 反应分三步 变性 退火 延伸 3 逆转录酶 可以以RNA为模板合成cDNA第一条链 或者以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA pr incipe doesmatter 可见 RT PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法 RNA模板 逆转录酶 DNA RNA杂化双链 RNase降解RNA 单链DNA DNA聚合酶 cDNA RT PCR Taq酶 2020 3 7 1 引物的特异性决定PCR反应特异性 2 引物设计原则的把握 1 引物长度 一般为15 30bp 2 碱基分布 3 3 端要求 4 引物自身二级结构 5 引物之间的二级结构 6 同源序列 7 5 端无严格限制 操作步骤 一 引物设计 2020 3 7 操作步骤 二 RNA的提取 2020 3 7 操作步骤 二 RNA的提取 2020 3 7 1 两步法RT PCR 操作步骤 三 cNDA合成 a常用的反应体系10 RT反应缓冲液2uldNTPMixture 各10mM 2ulRNAaseinhibitor 40U ul 0 5uloligo dT 181ul逆转录酶1ul总RNA0 5 1ugDEPC free水补足体系至20ul 2020 3 7 1 两步法RT PCR 操作步骤 三 cNDA合成 b操作 在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入8ul总RNA溶液 0 2mlEp管 迷你离心机离心数秒 放置PCR仪中 42 30min 合成cDNA第一链 85 5min 灭活逆转录酶 2020 3 7 2 一步法RT PCR 操作步骤 三 cNDA合成 在一步法RT PCR中 逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下 在同一管内进行 优势 在处理大量样品时易于操作 减少残余污染 可以得到更高的灵敏度 缺点 无法优化反应条件 一旦失败 必须重新提取总RNA 2020 3 7 2 一步法RT PCR 操作步骤 三 cNDA合成 0 1 1ug总RNA200一500umol L的dNTP 每种 0 5umol L基因特异引物 上下游 200UAMV逆转录酶1 Taq聚合酶缓冲液0 5 15mmol LMgCI21mmo1 LDTT1 5UTaq聚台酶终体积为50ul 2020 3 7 1 50ulPCR体系的组成 即一步法 操作步骤 四 PCR扩增 2020 3 7 2 PCR反应过程 操作步骤 四 PCR扩增 2020 3 7 1 引物退火温度的调节 一般在引物设计软件推荐温度的上下2 变化寻找最佳退火温度 2 此外Mg2 浓度的调节也非常重要 通常最佳浓度为2mM左右 3 引物和模板的量等 操作步骤 五 PCR条件的优化 2020 3 7 根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶 不同长度产物所需凝胶浓度 取适量PCR产物 加上样缓冲液充分混合 点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中 10V cm电泳45 60min 成像系统成像分析 操作步骤 六 产物的电泳和结果的测定 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 2020 3 7 实验原理 1 琼脂糖为链状多糖 绳状琼脂糖束 大网孔型凝胶 分离 鉴定 纯化DNA2 影响DNA迁移率的因素 DNA分子的大小 构象 凝胶浓度 电压 电泳缓冲液的组成 pr incipe doesmatter 2020 3 7 染色和照相 电泳 样品的制备与加样 选择电泳类型 选择电泳缓冲体系 琼脂糖凝胶的制备 2020 3 7 选择电泳类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型 平板型 STEPS doesmatter 2020 3 7 选择缓冲液系统 常用的电泳缓冲液有EDTA pH8 0 和Tris 乙酸 TAE Tris 硼酸 TBE 或Tris 磷酸 TPE 等 浓度约为50mmol L pH7 5 7 8 STEPS doesmatter 2020 3 7 凝胶的制备 以稀释的电泳缓冲液为溶剂 用微波炉配制一定浓度的溶胶 灌入水平胶框或垂直胶膜 插入梳子 自然冷却 STEPS doesmatter 2020 3 7 样品配制与加样 DNA样品用适量Tris EDTA缓冲液溶解 缓冲液内含有0 25 溴酚蓝或其他指示染料 含有10 15 蔗糖或5 10 甘油 以增加其比重 使样品集中 STEPS doesmatter 2020 3 7 电泳 在低电压条件下 线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比 因此为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率 电场强度不宜高于5V cm STEPS doesmatter 2020 3 7 染色与照相 常用荧光染料溴乙锭 EB 染色 在紫外光下观察DNA条带 用紫外分析仪拍照 或用凝胶成像系统输出照片 并进行有关的数据分析 STEPS doesmatter 2020 3 7 结果分析 一 影响琼脂糖凝胶电泳的因素 DNA分子的大小 实验证明 DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比 琼脂糖的浓度 一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中 电泳迁移率不相同 DNA分子的构型 不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大 2020 3 7 结果分析 二 常见问题的原因和解决 2020 3 7 结果分析 二 常见问题的原因和解决 2020 3 7 结果分析 二 常见问题的原因和解决 2020 3 7 结果分析 二 常见问题的原因和解决 2020 3 7 应用 1 PCR产物在琼脂糖凝胶上进行的电泳检测 doesmatter ication appl 2020 3 7 应用 2 琼脂糖在其他方面的应用 琼脂糖