山大生化实验报告 实验五、实验六 纤维素酶活力测定、.doc

实验五 纤维素酶活力测定（3,5-二硝基水杨酸法）实验六 3,5-二硝基水杨酸法测还原糖姓名：周超同组者：刘炳煜班级：11级生命基地学号：201100140067【实验目的】1、学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法2、学习用3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力【实验原理】1、3,5-二硝基水杨酸法测纤维素酶活力的原理纤维素酶水解纤维素，产生纤维素二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙色的氨基化合物，利用比色法测定还原物生成量来表示酶的活力。2、3,5-二硝基水杨酸法测还原糖的原理 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈橘红色，在540nm处有最大吸收，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可以测定样品中还原糖的含量。【实验材料】一、器材比色管、水浴锅、电炉、分光光度计、容量瓶100ml、烧杯、移液枪二、试剂1、标准葡萄糖溶液（1.0mg/ml）：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，溶于蒸馏水并定容至100ml，混匀，4C 冰箱中保存备用。2、3,5-二硝基水杨酸试剂：称取10克3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾难，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚3克，无水亚硫酸钠0.5克。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000毫升。存于棕色瓶中，放置一周后使用。3、0.1摩尔PH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液4、0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)水溶液，溶解后成胶装液，静置过夜，使用前摇匀。5、西瓜汁6、酶液（10ug/ml）【实验步骤】一、 纤维素酶活力测定（3,5-二硝基水杨酸法）1、 标准曲线的绘制：分别吸取0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的葡萄糖于6支试管中（分别记为1,2,3,4,5,6），均用蒸馏水稀释至1毫升，加3,5-二硝基水杨酸显色剂3毫升，在沸水浴中煮沸显色10分钟，冷却，加蒸馏水定容至25毫升，摇匀。在550nm处比色，以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘制标准曲线。2、 样品的测定：空白管（记为A0）：取1ml酶液与比色管中，沸水浴中溶5min，冷却后加3ml的0.5%CMC，与样品管同时放入水浴锅中50度保温30min。其他操作同样品管。样品管（记为A1，A2，A3）：另取3支比色管分别加0.5%CMC 3ml，酶液1ml，在水浴锅中50度保温30min，取出后立即用沸水溶10min，冷却。加入3ml 3,5-二硝基水杨酸显色剂，再沸水浴10min，冷却后再加水定容至25ml，混匀，在550nm处比色二、3,5-二硝基水杨酸法测还原糖含量1、标准曲线的绘制：分别吸取0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的葡萄糖于6支试管中（分别记为1,2,3,4,5,6），均用蒸馏水稀释至1毫升，加3,5-二硝基水杨酸显色剂3毫升，在沸水浴中煮沸显色10分钟，冷却，加蒸馏水定容至25毫升，摇匀。在550nm处比色，以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘制标准曲线。2、取西瓜汁3ml定容至100ml备用3、取3支比色管，分别加入0.5ml的西瓜汁、0.5ml的水和3ml显色剂，沸水浴中10min，冷却后加水定容至25ml，混匀，在550nm处比色。【实验结果】一、纤维素酶活力的测定标号123456A0A1A2A3550nm吸光值00.1210.280.4340.5480.6890.040.5150.5150.496还原糖浓度（mg/ml）00.0080.0160.0240.0320.040.00230.02970.02970.0286还原糖浓度=（0.0297+0.0297+0.0286）/3=0.0293mg/ml酶活力=0.0293*25*1000/（10/1000000）/30=2.44x106标号123456789550nm吸光值00.1210.280.4340.5480.6890.33803300.358还原糖浓度（mg/ml）00.0080.0160.0240.0320.040.0200.0190.021二、3,5-二硝基水杨酸法测还原糖含量还原糖浓度=（0.02+0.019+0.021）/3=0.02mg/ml西瓜汁中还原糖浓度=(0.02*25/0.5)*100/3=33.33mg/ml【结果分析】一、纤维素酶活力的测定1、由实验结果可知，纤维素酶水解纤维素，水解产物中有葡萄糖等还原糖，1g纤维素酶活力为2.44106。2、在本实验中，一定要注意控制好时间，严格实验操作。样品管A1，A2，A在水浴锅中50度保温30min后，应取出后立即用沸水溶10min，使酶失活，这一步一定要保证3个样品管的反应时间相同。二、3,5-二硝基水杨酸法测还原糖含量1、西瓜汁中还原糖的浓度为33.33mg/ml。2、在进行比色时，一定要将溶液混匀再进行测定。【思考讨论】一、纤维素酶活力的测定1、 通过本次实验的测定，可以看出纤维素酶可以水解纤维素，生成葡萄糖等还原糖。2、 通过本次实验，还可以得出，纤维素酶的最适PH为4.5，最适温度为50度。在实际的应用中，也应该关注影响酶活力的因素，寻找最佳条件，以达到最大催化效率。3、 本实验中，直接测纤维素酶的活力有困难，而使用比色法测还原糖浓度较简单，所以我们通过测定生成的还原糖浓度来间接测纤维素酶的活力，这样操作简单，数值也较准确。在实验中，当直接测量有难度时，我们可以考虑通过间接法来测量。二、3,5-二硝基水杨酸法测还原糖含量1、严格控制1-9号比色管的