EGFL7与肿瘤研究新进展.doc

EGFL7 与肿瘤研究新进展来源:摘要：EGFL7 蛋白为一种内皮细胞特异性分泌因子，它是血管管腔形成所必需的因子，它的缺乏将导致管腔形成受阻，从而影响血管功能的完善。其在早期胚胎的血管中有较强的表达，而在成年人仅在少数器官（如：心脏、肺脏、肾脏）和肿瘤、炎症组织中有高水平表达。在肿瘤的生长转移过程中新生血管的作用十分重大，阻断肿瘤新生血管EGFL7 的表达将有助于抑制肿瘤生长和转移，为肿瘤治疗提供一个新的途径。关键词：EGFL7；肿瘤；血管新生；浸润；转移0 前言肿瘤的侵袭转移是恶性肿瘤患者死亡的主要因素1,2。研究表明具有不同遗传背景的肿瘤细胞侵袭转移的步骤基本相似，包括原发性肿瘤的生长，新生血管的形成，肿瘤细胞的脱落及血管内渗或通过淋巴系统间接进入血液循环，逃避免疫攻击到达新的器官，随后肿瘤细胞通过血管外渗进入新组织，首先增殖形成无血管微小转移灶直至新生血管形成并进一步发展成肉眼可见的肿瘤转移灶1。其中血管内皮细胞及其分泌因子在肿瘤从原发灶进入血液以及通过血流进入特定转移部位的过程中发挥了关键性的作用3,4,5。由此可见抑制肿瘤血管的新生将对肿瘤的治疗具有重大意义。近年来众多学者报导了一种新的基因表皮生长因子样结构域7（EGFL7）,又称为VE-statin，Neul，Notch4-lik 等，研究显示它在生理性和病理性血管的管腔形成、功能完善上发挥着重要作用，它的表达改变将影响血管的新生，因此EGFL7 已成为目前肿瘤治疗研究的一大热点。1 EGFL7 基因和EGFL7 蛋白的结构Park 以及Soncin 的实验室分别于2003 年和2004 年发现了一个在血管内皮特异性表达的基因6,7，分别将其命名为VE-statin 和EGFL7。哺乳动物的EGFL7 基因属于一个小基因家族，Soncin 等人7用EGFL7 探针进行荧光原位杂交（FISH）染色体定位显示人类和小鼠的EGFL7 基因分别定位于9 号和2 号染色体上，RH 绘图证实人类9 号染色体上的EGFL7基因与WI-17482 相邻，位于9 号染色体长臂的末端。小鼠的EGFL7 基因跨度大约为10Kbp，有11 个外显子和内含子，其中包括可选择性的外显子1a 和1b，分别对应EGFL7 编码基因a 和b 两种不同的转录产物，外显子9 的可选择性表达导致了不同克隆的产生。人类和小鼠的EGFL7 蛋白翻译起始点分别位于密码子AUG281-283 和AUG309-311,翻译终止点两者基本相似。EGFL7 基因编码一个相对分子量为30KDa 的蛋白，该蛋白的结构中包含了一个信号肽序列，该序列的出现说明EGFL7 是一个分泌蛋白，在其氨基端有一个EMI 结构，具有调节细胞间粘附的作用8,9，另外有两个EGF 样结构和富含赖氨酸、缬氨酸的羧基端。EGF样结构是蛋白间识别的关键结构，它可出现在一系列的膜蛋白和分泌蛋白中，如血液凝固蛋白因子、蛋白C 的酶、尿激酶等10。EGF 结构也与细胞表面蛋白间的识别有关，如Drosophila Notch 和其Delta 受体的识别11。一般来说，含有EGF 样结构的蛋白是分泌蛋白或跨膜蛋白或细胞外基质的组成成分（前列腺素G/H 合成酶例外12）。Fitch 等人13的研究显示在EGFL7 的第一个EGF 样结构中发现了与DSL 结构相似的结构，DSL 结构在Notch的受体中存在。第二个EGF 样结构有Ca2+位点，EGF 样结构家族功能的发挥被认为与Ca2+有关，如纤维蛋白原失去了与EGF 结构相结合的Ca2+后蛋白的结构发生了改变10,14,15，因子的氨基酸Ca2+结合位点的变异将导致血友病B 的发生16，纤维蛋白原-2 的Ca2+结合位点的变异与Manfan 氏综合征有关17,18,19。应用小鼠的EGFL7 氨基酸序列查阅相关数据发现人类、小鼠和非洲爪蟾的EGFL7 序列相近，小鼠与人类有73%的相同序列，与大鼠有88%的相同序列，与非洲爪蟾有45%的相同序列，它们的EGFL7 蛋白均有信号肽、EGF 样结构和DSL 样结构，除了以上的结构外，在其它的序列中也显示了同源性13，说明EGFL7 有高度的物种保守性。2 EGFL7 基因的表达及其分布特点2.1 早期胚胎中 EGFL7 的表达Fitch 等人13应用RT-PCR 研究E3.5 和E4.5 天的未种植胚泡发现了EGFL7 特异性转录产物，说明胚胎发育早期即有EGFL7 的表达。Northern blot 分析显示从E7.5 到E8.5EGFL7表达增加，此后维持在一个相对恒定的水平。flk-1 为血管母细胞和内皮细胞的早期标志物，它在胚胎发育的早期E6.5-7.0 即有表达，用体外模型分析EGFL7 和flk-1 的表达谱发现两者相似，从第三天开始表达上调，至第七天到达顶峰，因此认为EGFL7 是一个胚胎早期基因。但Fitch 等人研究指出EGFL7 的出现早于flk-113。关于EGFL7 在胚胎中出现的时间和其是否早于flk-1 表达，Socin7认为EGFL7 在原始内皮细胞分化的很早阶段（E7.5）就开始表达，与其它内皮细胞标记物相比较，EGFL7 表达于血管岛中而不在E7.5 时的中胚叶，且稍晚于flk-1，与tie-220,21和VE-cadherin22的表达同时出现，比tie-1 的表达要早0.5 天23。不论EGFL7的表达是早于还是晚于flk1，所有研究者的研究结果均显示在胚胎早期（E3.5 和E7.5）有EGFL7 表达，目前对于其是一个早期胚胎表达性基因已没有怀疑，因在肿瘤中EGFL7 的表达是上调的，这就为人们将EGFL7 作为肿瘤早期标记物及时予以检测及后续评估提供了理论依据。2.2 EGFL7 表达的物种及空间分布EGFL7 在物种间有高度的保守性，在不同的物种中均可检测到其表达。在小鼠、人类及石斑鱼胚胎的原始内皮细胞、各种血管的内皮细胞及心内膜中均可检测到EGFL7 的高水平表达，并且在从胚胎到新生儿的发育过程中EGFL7 均有强烈的持续性表达，但是在成年个体中并非所有器官均有表达，在成年小鼠的一些富含血管的器官如肺脏、心脏和肾脏中有部分血管持续性表达EGFL7，可能与这些器官在出生后仍有血管的生成和改建有关。在一些增殖性组织中，如肿瘤、妊娠期的子宫及炎症组织中有大量血管新生的现象，其EGFL7的表达较其它正常组织而言出现明显的上调，说明EGFL7 的高水平表达与血管的生长和重塑有关。Soncin7在其研究报告中指出EGFL7 的表达严格的限定于内皮系统，在E7.5 时EGFL7只能在血管岛中检测到，E10.5 时在脐静脉和脐动脉、腮动脉的三、四级分支、背大动脉中可检测到，在E13.5 时仍严格表达于内皮细胞，如大脑、肝脏、心内膜、肺脏、肋骨周血管网及视网膜的色素层。出生后EGFL7 的表达仍然限于内皮系统，Campagnolo 等人24采用RNA 原位杂交和免疫荧光检测发现在所有成熟血管中均发现了EGFL7mRNA 和蛋白的表达，且EGFL7 的表达严格限定于处于休眠状态的血管内皮中，在内膜的平滑肌细胞中没有检测到EGFL7 的表达。细胞培养也显示了EGFL7 的表达限定于内皮细胞，而且限定于未经转化的内皮，在成年血管内皮瘤源性EOMA25和原始内皮细胞HUVEC 和BAEC 中发现了高水平表达的EGFL7，而在转化的内皮细胞系如fps/fes 转化的卵黄囊源性内皮细胞系C16726、heSV40 转化的周围淋巴结源性内皮细胞系SVEC27中仅有背景水平的EGFL7 表达。在非内皮细胞系如平滑肌细胞、人类T 细胞白血病细胞系、Hela、NIH3T3 和HEK293中没有或仅有很低水平的EGFL7 表达。有研究显示虽然EGFL7 严格表达于内皮细胞系统，但其表达不限于血管的类型和大小，在肾静脉和肾动脉以及在肾小管周血管、肾小球有窗毛细血管网及弓形血管和小叶血管中均有EGFL7 的表达很好地证明了这点7,24。EGFL7 表达于内皮细胞系统，但在不同的器官中其表达的水平是不同的。Campanolo等人24指出EGFL7mRNA 的水平在不同的器官中存在差异，在同一器官不同的血管床中的其表达水平也不尽相同，如在心脏中血液流出道和心房的内皮细胞中EGFL7 高表达，而在心肌层的毛细血管中则检测不到EGFL7 的mRNA 和蛋白的表达。3 EGFL7 与血管形成、血管新生和血管损伤修复哺乳动物最早的血管结构发育自卵黄囊，内皮细胞发生聚集形成血管丛，血管丛随后分化为血管岛，然后由内皮细胞围成管腔结构，内充满了胚胎性造血细胞。随后的血管系统形成过程分为两个阶段：中胚叶来源的血管母细胞分化为内皮细胞，内皮细胞相互连接形成原始的血管13。血管新生是指从已经存在的血管中通过出芽的方式形成新的毛细血管和大血管的过程。典型的血管新生出芽过程包括休眠的内皮细胞的活化、细胞外基质的降解、细胞趋化性的迁徙、进入周围基质、内皮细胞的增殖和分化、形成新的管腔和血管成熟28-32。这种血管新生发生于生理状态下，如女性的生殖过程及伤口的愈合，也见于病理性的情况，如肿瘤的转移、风湿性关节炎、视网膜病、动脉瘤及银屑病28,31,33,34。血管形成和血管新生受到一系列复杂的生长因子和其受体的调控，如内皮源性血管上皮生长因子（VEGF/VEGFR）、血管紧张素/tie 信号途径35,36、ephrins、转化生长因子、成纤维细胞生长因子及其受体37以及Notch 信号途径38,39。虽然目前对以上的信号传导途径已有所认识，但尚有些问题无法解答。部分学者在研究EGFL7 时发现其在调节内皮细胞的粘附和指导内皮细胞迁徙以及抑制血管平滑肌细胞迁徙方面有着重要的作用。在血管发育的过程中内皮细胞的迁徙是关键步骤，内皮细胞以集体的形式进行迁徙，在迁徙过程中EGFL7在维持其正常的空间结构和迁徙方向上发挥了重要作用。Schmidt 等40发现EGFL7 有助于内皮细胞间的连接，其连接强度较其它的基质蛋白要弱6。缺乏EGFL7 将使内皮细胞间的粘附增加，导致其持续性的聚集，形成一个过大的细胞芽，使血管新生过程中的细胞芽失去细胞正常的空间结构，影响正常血管腔的形成。与血管生长因子VEGF、FGF-2 和血管紧张素-1 不同的是EGFL7 并不刺激内皮细胞的增生，只促进内皮细胞的迁徙和血管床结构的形态发生24,41。除了影响内皮细胞外，EGFL7 对_血管平滑肌细胞也有作用。Soncin 等13指出EGFL7 可抑制平滑肌细胞的迁徙但不影响其增殖，这与其它平滑肌迁徙抑制因子如TGF-42、PTEN等不同，它们不仅抑制平滑肌迁徙而且抑制其增殖。EGFL7 在血管壁细胞与毛细血管相接触前便抑制了平滑肌细胞的招募，使快速生长的组织发生血管成熟延迟。但由于EGFL7 不影响平滑肌的增殖，故并不影响已有平滑肌细胞存在的血管的形成。在成年组织中的那些已有稳定壁细胞的血管中，EGFL7 的表达阻止平滑肌细胞从血管中迁徙出去，以确保血管的稳定。EGFL7 可能阻止平滑肌细胞的凋亡，这种作用对于动脉硬化和保持肿瘤血管的稳定性有重要的作用。在成年的哺乳动物组织中血管通常都处于休眠状态24，成年组织的大多数血管中EGFL7 是处于低表达或不表达状态的，但Campagnolo 等 24发现在损伤的动脉中EGFL7可暂时性的表达上调，认为这种变化和血管腔的再内皮化有关，在大量内皮细胞发生增殖和迁徙的地方发现了EGFL7 的大量表达，在所有的损伤模型中其表达都限于内皮细胞，而不存在于内膜的平滑肌细胞，在人类的动脉粥样硬化的管腔内皮中也发现了高表达的EGFL7。对处于增殖、迁徙和重建状态下的动脉内皮细胞而然，Campagnolo 的实验结果显示EGFL7是其特异性的标记物。值得一提的是，虽然很多研究者在其研究中均发现EGFL7 在趋化内皮细胞迁徙中起作用，但仍有部分学者对此有不同的看法。如Soncin13和Parker6两个实验组均未发现EGFL7在内皮细胞迁徙中起作用，Campagnolo24也未发现EGFL7 能刺激人脐静脉内皮细胞发生迁徙。4 EGFL7 与肿瘤的浸润转移在肿瘤转移的多个步骤中，血管系统发挥了重要的作用43，包括在转移部位捕获血流中的肿瘤细胞并提供进入器官的途径，通过血管新生为原发灶肿瘤提供生长所需的营养及内渗所需的入口。当肿瘤的直径超过2 mm 的时候大量新生血管开始生成，研究发现在这些新生血管的内皮细胞中均有EGFL7 蛋白的表达上调24。新生肿瘤血管的管壁上有大量的通道和空洞，内皮细胞之间的连接处较宽，存在不连续性基底膜或者基底膜缺如，这使得肿瘤细胞易于从原发部位进入血液循环。肿瘤新生血管的这些特点可能与EGFL7 表达上调情况下内皮细胞运动能力过度增强有关。高表达的EGFL7 分泌出细胞外，可能在肿瘤血管内皮细胞及运动能力异常增殖的肿瘤细胞之间形成化学梯度，从而趋化肿瘤细胞血管内渗入血流造成全身的扩散。肺脏是各种主要经血流进行转移的肿瘤最好发的转移部位，很多学者的研究也证实成年组织中肺组织中有EGFL7 的高水平表达6,13,24。EGFL7 在肿瘤的转移过程中可能在以下两个方面参与：（1）EGFL7 蛋白通过自分泌或旁分泌的方式刺激肿瘤细胞本身的运动迁移能力，参与肿瘤从原发灶向周围浸润转移；（2）肿瘤内皮细胞分泌EGFL7 蛋白易化肿瘤细胞从原发灶内渗入血流，而器官特异性微血管内皮细胞也通过表达EGFL7 蛋白从血流中能捕获肿瘤细胞并易化其血管外渗进入新的组织器官，从而导致肿瘤器官特异性转移灶的形成。5 展望肿瘤生长至 2 mm 时便需要新生血管为其提供营养物质和带走代谢产物，在肿瘤的转移过程中也需要新生血管的参与，而在新生的血管中EGFL7 的表达上调，并且是新生血管形成管腔和功能完善所必需的因子，这就提示我们EGFL7 可以成为肿瘤的一个早期预测因子，阻断肿瘤中EGFL7 的表达可以阻止肿瘤性血管管腔的形成，从而成为无功能血管，阻止肿瘤的生长和转移，为肿瘤治疗提供一个新的途径。参考文献（References）1 Chambers AF，Groom AC，MacDonald ICDissemination and growth of cancer 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