外源蛋白在大肠杆菌中的高效表达.doc

提高外源性蛋白在大肠杆菌中的高效表达策略 本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养的特点，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。影响大肠杆菌中蛋白表达量的因素有载体启动子结构、质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素。在分析了国内外有关在原核系统中表达蛋白的实验资料的基础上，对在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略所涉及的内容进行总结，以期有助于研究。1. 有效表达载体的构型构建表达质粒需要多种元件，需要仔细考虑它们的组合，以保证最高水平的蛋白质合成。其主要构件包括启动子、终止子、抗终止子、弱化子、绝缘子和增强子等。11启动子理想的启动子具有以下特性：作用强;可以严格调控;容易转导入其他E.coli以便筛选大量的用于生产蛋白的菌株，而且对其诱导是简便和廉价的1。在启动子下游是RBS，其跨度约为54个核苷酸，两端限定在-35（2）和mRNA编码序列的+19到+22之间2。Shine-Dalgarno(SD)位点在翻译起始阶段与16SrRNA的3端相互作用3。SD与起始密码子间的距离约为5-13bp，而且此区的序列在mRNA转录物中应避免出现二级结构，否则将会降低翻译起始的效率4。在RBS的5和3端均为A丰富区。转录终止子位于编码序列的下游，作为转录终止的信号和组成发卡结构的保护性元件，阻止核酸外切酶对mRNA的降解，从而延长mRNA的半衰期。但目前发现在转录过程中部分启动子在转录为RNA后可引起导致转录后基因沉默，从而减少目的蛋白量（a）。某些启动子还识别特异性的RNA聚合酶（ rnap ），特异性的RNA聚合酶（ rnap ）可以分辨出不同的启动子结构，优先启动推动者与目的序列。（c）还有研究表明有关基因表达的假设增强子与启动子之间相互作用发生分子间的结构独立功能联合的复合体增强启动子功能，该结构具有特异性。并不是所有增强子与启动子都能发生功能联合的复合体（b）。目前在E.coli中发挥作用的启动子很多。通常常被使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。12终止子 在一个基因的3末端或是一个操纵子的3末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。在原核生物中，转录终止有两种不同的机制。一种是依赖六聚体蛋白rho的rho依赖性转录终止，rho蛋白能使新生RNA转录本从模板解离，它是一种环状hexameric蛋白质和ATP解旋酶的活动。nusg ，nusa和nusb是以附加因素的形式参与终止进程。 rho依赖性终止作用是当rho与游离核糖体中富含C 的位点相结合后产生的， rho的ATP酶激活rho - mRNA的终止子作用，并为其提供能量，使rho能够在mRNA上向前移行;移行过程中是mRNA上的讯息进入六聚体的中心孔，当移行到转录底物释放rho的解旋酶时聚合酶停止工作转录终止（d，e）。另一种是rho非依赖性转录终止，它特异性依赖于模板上编码的信号，即在新生RNA中形成发卡结构的一回文序列区，和位于该回文序列下游4-9bp处的dA、dT富含区5。贯穿启动子的转录将抑制启动子的功能，造成所谓的启动子封堵6。这种效应可以通过在编码序列下游的适当位置放置一转录终止子，阻止转录贯穿别的启动子来避免。同样地，在启动目的基因的启动子上游放置一转录终止子，将最大限度地减小背景转录7。同时对于大肠杆菌来说，翻译终止效率可因终止密码子及临近的下游碱基的不同而显著不同，对于UAAN和UAGN系列终止密码子下游碱基对翻译的有效终止的影响力大小依序为UGA、C。UAG极少被大肠杆菌利用，相比UAAN和UGAN，UAG表现了有效终止，但其后的碱基对有效终止的影响力为UGAC。13抗终止子细菌中许多参与氨基酸生物合成的操纵子在其第一个结构基因的5端含有转录衰减子。衰减子由特定操纵子的氨基酸产物调节。这样关联的带电荷tRNA的存在就会在核糖体剪切之后引导初始转录本中二级结构的形成。如果没有关联的带电荷tRNA，则会形成抗终止子结构，从而抑制终止子中发卡结构的形成和转录的终止8。其中hutp是一种RNA结合蛋白表达的调节有关氨基酸利用率的操纵子，具有约束力的顺式调控序列。（g）它要求组氨酸和镁离子结合才能进行mRNA的表达。在研究中，已证明了几个二价阳离子可调解hutp RNA的相互作用。最好的二价阳离子被锰，锌和镉，其次是镁，钴和镍离子，而铜离子， yb2 +和Hg2 +无效。在hutp RNA的互动中表明金属离子能调解蛋白质核酸相互作用，增强mRNA的转录(f)。在rho依赖性终止中抗终止元件能使RNA多聚酶越过核糖体RNA操纵子中的rho依赖性终止子即boxA9,从而达到抗终止子的作用。14弱化子弱化子(attenuator)是在研究大肠杆菌的色氨酸操纵子表达弱化现象中发现的。在trp mRNA 5端trp正基因的起始密码前有一个长162 bp的DNA序列称为前导区，其中第123150位核苷酸能影响色氨酸的表达，如果缺失，trp基因的表达水平可提高6倍。这个区域被称为弱化子。弱化作用在原核生物中是相当普遍的，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中已陆续发现不少操纵子都有弱化现象。例如在AmpC酶的表达过程中，其基因上的弱化子为一段不稳定的发卡结构（h）,但这段发卡结构较易突变，若其上1643基因缺失将改变这一结构使其弱化作用消失（i）。15绝缘子绝缘子(insultor)长约几百个核苷酸对，是通常位于启动子同正调控元件(增强子)或负调控因子(为异染色质)之间的一种调控序列。绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用，其作用机制可能是取消核酸的碱基的配对作用，和阻断增强子机制(j).16增强子增强子（enhancer）指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列。增强子是通过启动子来增加转录的。增强子的特点是：在转录起始点5或3侧均能起作用；相对于启动子的任一指向均能起作用；大部分增强子发挥作用与受控基因的远近距离相对无关，但也有小部分增强子其作用与受控基因的远近有关（K）；对异源性启动子也能发挥作用；通常具有一些短的重复顺序。如今已经在细菌和噬菌体中鉴定了一些在E.coli中显著增强异源基因表达的序列。Olins等从T7噬菌体基因10前导序列（g10-L）中鉴定了一9bp的序列，该序列似乎能替代有效的RBS。同SD共有序列相比，g10-L能使多种基因的表达水平提高40-340倍10。另外的研究小组在mRNA的5非翻译区（UTR）鉴定了一U富含序列，该序列同样具有翻译增强子活性。McCarthy等11在E.coliatpE基因中紧接于SD位点下游鉴定一类似区域。同时增强子的作用强弱与细胞培养的理化条件有一定的关系，例如，当在缺氧的条件下(EPO)3增强子野生片段或其突变片段其作用将不是增强目的基因的表达，而是相反起到抑制作用（L）。而且部分增强子的作用强弱与其所转入细胞也有关系。（m）2. 培养条件E.coli中的蛋白质产量可以通过高细胞密度培养系统而获得显著提高。高细胞密度培养系统可以分成三类：分批培养、补料分批培养和连续培养。这些方法能获得超过100g/升的细胞浓度，从而获得廉价的重组蛋白。培养基的组成需要仔细地计算和监控，因为这对细胞和蛋白质的产生具有重要的代谢效应。营养成分和培养参数如pH、温度和其他参数都会影响蛋白酶的活性、分泌和产量12。已经证明对培养基的特殊操作能明显提高蛋白质释放到培养基中。例如，在培养基中添加甘氨酸能增强外周质蛋白释放到培养基中，且不引起明显的细菌裂解13。同样，在山梨糖醇和甘氨酰甜菜碱存在的渗透压力下培养细菌，可以使可溶性的活性蛋白产量提高多达400倍14。同时，在表达外源蛋白时，要尽量避免由于营养物质缺乏导致的菌体生长抑制的情况发生外源蛋白的表达显著地受葡萄糖浓度的影响，虽然葡萄糖比较适合作为菌体生长的碳源，但在诱导表达时期，需尽量保持低水平的葡萄糖以甘油代替葡萄糖作为表达外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效应的有效途径之一。外源蛋白的构象也是影响可溶性表达量的重要条件，可通过影响外源蛋白的化学键的形成来影响结构的改变。例如，外源蛋白二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程，向培养基中添加适量的金属离子，可能提高这些酶类的活性，因此也有可能增加可溶蛋白的表达量某些外源蛋白的活性和稳定性与某些金属离子密切相关，因此向培养基中添加外源蛋白所需金属离子也可能提高蛋白的可溶性和稳定性15另外，良好的通气能有效降低培养基中对菌体表达蛋白有重要影响的CO2和乙酸的浓度，也有助于获得高产量的活性蛋白。同时，高细胞密度培养系统也有其自身的缺陷。这些缺陷包括在高细胞密度情况下，溶解氧的量有限；二氧化碳水平能够降低生长速度、刺激乙酸形成降低发酵罐的混合效率和产热等。利用高细胞密度培养系统生产重组蛋白质的一个主要问题是乙酸的积累，近来这一问题通过将来自B.subtilis编码醋酸盐合成酶的alsS基因导入E.coli细胞中得以解决16。3. 诱导条件目前对于蛋白质在大肠杆菌中表达的诱导剂主要有半乳糖苷酶（IPTG）、乳糖和胞外超氧化物歧化酶等。在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白时，诱导时机和诱导剂的用量必须严格控制普遍认为在低菌体浓度下诱导比较合适，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达目前一般认为在菌体浓度在OD600在0.40.6之间效果较好，但Margret B等认为在OD600为0.52.0同样可获得较好的效果17。诱导剂种类及其浓度都会对外源蛋白表达产生重要影响，应根据所采用的表达系统(比如启动子的强弱)和外源蛋白的特点优化选择18。目前，普遍认为在低温、低诱导剂浓度的情况下可以获得可溶蛋白的高效表达。在温度为2830的时候可以避免不必要的蛋白构象改变，更有利于菌体形成稳定的可溶性蛋白。但是降低培养温度并不能促进所有外源蛋白的可溶性表达，因为某些外源蛋白在42时完全可溶。因此不能简单的认为低温就有利于外源蛋白的可溶性表达。蛋白质的蛋白酶解蛋白酶解是一个选择性的、高度调节的过程，该过程参与许多代谢活动。E.coli在细胞质、细胞外周质、内膜和外膜有许多蛋白酶。这些蛋白酶参与宿主的代谢活动，如选择性地清除异常和错误折叠的蛋白。到目前为止，蛋白酶解的机制尚未完全明了，但已有一些策略和方法以减少E.coli中异源蛋白的降解。虽然使得蛋白质不稳定的精确结构特点还不清楚，但是通过系统研究已经明确了一些蛋白不稳定的决定因素。蛋白酶解途径的“N-末端规则”在E.coli中能够发挥作用，即蛋白质的稳定性与其氨基端的残基有关。在E.coli中，末端Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和Trp的半衰期为分钟，而除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超过10小时。有研究表明，在多肽的第二位带有较小侧链的氨基酸有利于甲硫氨酸氨肽酶催化的N-末端甲硫氨酸的去除，从而暴露出位于第二位的亮氨酸，使得该蛋白不稳定。蛋白质的第二个决定因素是位于近氨基端的特异性内源赖氨酸残基。该残基是多遍在蛋白（Polyubiquitin)链的受体，多遍在蛋白链在真核细胞中有利于遍在蛋白依赖的蛋白酶对蛋白质的降解。减少E.coli中重组蛋白裂解的策略有以下几种：（1）将蛋白质靶向细胞周质或培养基；（2）在较低的温度下培养细菌；（3）选用蛋白酶缺陷的菌株；（4）构建N-末端或C-末端融合蛋白；（5）将目的基因多拷贝串联；（6）与分子伴侣共表达；（7）与T4pin基因共表达；（8）替换特定的氨基酸残基以消除蛋白酶裂解位点；（9）改善蛋白质的亲水性；（10）优化培养条件等。另外，mRNA的快速降解也势必影响蛋白质的产生。在E.coli中有多种不同的RNase参与mRNA的降解，其中包括内切核酸酶（RNaseE,RNaseK和RNaseIII）和3外切核酸酶（RNaseII和多聚核苷酸磷酸化酶PNPase），目前尚未在原核细胞中发现5外切核酸酶。mRNA的降解并非由非特异性的外切核酸酶随机剪切而引起，因为在mRNA的长度和半衰期之间并没有反向相关性。已经证明，在E.coli中有两类保护性元件能够稳定mRNA。一类由mRNA的5UTRs中的序列组成，5UTR能通过在5末端添加发卡结构来延长在正常情况下不稳定的mRNA的半衰期；另一类由3UTRs和多顺反子间区的发卡结构组成，由3UTR组成的mRNA保护性元件能够形成发卡结构，因而能够阻断外切核酸酶从3末端对转录本的降解。4. 蛋白质靶向确定将目的蛋白表达在特定的细胞室，即细胞质、细胞间质或是培养基中，需要权衡各自的利弊。1 细胞质表达包涵体的形成仍然是在细胞质中进行基因表达的一个主要障碍。包涵体虽然具有多方面的好处，但这些优越之处与后期繁琐的蛋白重新折叠工作、重叠蛋白的生物活性的未知性以及重叠和纯化后蛋白的总产量降低相比，则显得微不足道。至今尚不明了包涵体形成的精确机制。对于形成和不形成包涵体的81种蛋白质的统计学分析表明，有6个主要的理化指标与此有关。这6个指标是电荷平均数、转变形成的残基组分、半胱氨酸组分、脯氨酸组分、亲水性和残基总数。其中前两个指标与包涵体形成密切相关。已经建立了多种策略以帮助蛋白质天然空间结构的形成。这些策略包括在较低温度下培养细菌，选择不同的E.coli菌株，替换某些氨基酸残基，与分子伴侣共表达，利用高溶解性的多肽作为共表达分子，在山梨糖醇和甘氨酸三甲内盐存在时，以低渗透压培养和诱导细，改变培养基的pH值。与分子伴侣共表达或许是一种有望提高蛋白质可溶性和折叠效率的途径。 2细胞外周质表达在细胞外周质进行蛋白质表达有许多优越之处。在外周质只有4%的总细胞蛋白，这显然有利于目的蛋白的纯化，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在转移到外周质的过程中，信号肽在细胞内剪切更有可能产生目的蛋白的天然N-末端。此外，外周质中的蛋白质降解也少得多。蛋白质通过内膜转运到外周质需要信号肽。许多原核和真核细胞来源的信号肽已成功地用于Ecoli中蛋白质从内膜到外周质的转运。如E.coli的PhoA信号、OmpA、OmpT、LamB和OmpF以及金黄色葡萄球菌的A蛋白，鼠RNase和人生长激素信号肽等。但是，蛋白质转运到细菌外周质是一个特别复杂和尚未完全明了的过程，信号肽的存在并不总能保证有效的蛋白质通过内膜转运。改善蛋白质转运到外周质的策略包括提供蛋白质转运和加工所需的成分：过量表达信号肽酶I，利用prlF突变株，共表达参与膜转运的几种蛋白质，降低蛋白质的表达水平以防止转运工具的过载。 3细胞外分泌（外泌）将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的裂解。但是，E.coli在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外。要解决蛋白质外泌方面的难题，必须弄清E.coli的分泌途径。Pugsley对革兰氏阴性菌的分泌途径进行了详细的研究。在E.coli中将蛋白质分泌到培养基中的方法大致分为两类：（1）利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径；（2）利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。第一种方法具有将目的蛋白质特异性分泌的优点，并最小限度地减少了非目的蛋白的污染。第二种方法依赖于有限渗透的诱导而导致蛋白质的分泌。5. 分子伴侣Ellis于1987年在英国（nature）杂志上正式提出“molecular chaperone”的概念，分子伴侣的概念几经修正，1997年Ellis对分子伴侣的定义是Do molecular chaperone have to do protein一大类相互没有关系的蛋白，他们具有的共同功能是帮助其他含蛋白的结构在体内进行非共价组装或卸装。目前较被认同的分子伴侣的概念是能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象, 并能通过有控制的结合和释放, 促进新生多肽的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输等的一类蛋白。分子伴侣主要是指在进化上非常保守的热休克蛋白(heat shock p rotein 或HSP) 的几个家族。目前作为分子伴侣的热休克蛋白主要包括三个家即h sp70 家族, h sp90 家族和h sp60 (chaperonin, 伴侣蛋白) 家族。现已发现分子伴侣在蛋白质的折叠、组装及解离、错叠(malfolding) 多肽的降解过程中起到非常重要的作用。分子伴侣蛋白按分子量大小可分为H sp100, 90, 70, 60, 40, 25 等(o)。分子伴侣作用机制是与靶蛋白形成复合物。流行的一种模型认为分子伴侣常常以多聚体形式形成中心空洞的结构, 推测靶蛋白可以在与周围环境隔离的中间空腔内不受干扰的进一步折叠。由此提高靶蛋白的自然构象比例。分子伴侣再提高靶蛋白的自然构象比例的同时，也有利于蛋白的细胞外分泌，例如hsp40等其作用在于能影响细胞壁的完整性，其影响编码蛋白激酶C ，并与细胞壁生成有关，能造成细胞壁缺陷，使胞内蛋白分泌到培养基中 （n）.但分子伴侣的表达同样受到外界理化条件的影响例如加热，加热可以提高分子伴侣作用，但温度过高又会增加包涵体的比例，影响目的蛋白的胞外分泌表达，所以温度的控制随着目的蛋白的不同和所用分子伴侣的不同而不同。(p)7小结一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一位于翻译起始密码子5端大约9bp的SD序列；位于目的基因3末端的一个高效转录终止子。除此之外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。这种调节元件可以插入载体自身，也可以插入宿主的染色体。其他的元件包括转录和翻译增强子等。这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同的情况加以取舍。尽管目前在E.coli中表达外源基因方面已经有许多重大进展，但仍有许多问题亟待解决。归纳起来主要有以下几点： 1借助于细胞的分子伴侣机制来提高正确折叠的蛋白质的产量。或许可以通过共表达多种分子伴侣编码基因和通过激细胞内众多不同的分子伴侣的方法来实现。 2在E.coli中表达真核膜蛋白和多亚基蛋白质复合物的难题上有待解决。 3蛋白质分泌到培养基中的真正和有效机制需要明了。目前已经有多种体系能够使重组蛋白质分泌到培养基中。其中有些是利用信号肽、融合伴侣和具有穿透能力的因子，这种因子能够引起外膜的破坏和有限的渗漏。而另外的策略是利用已经存在的分泌通道，来保证更高特异性的分泌。4赋予原核细胞诸如真核细胞那样进行翻译后修饰的能力。例如糖基化、磷酸化、乙酰化和酰氨化等。参考文献1.Yansura D G, Henner D J. Methods Enzymol. 1990, 185:54-602.Huttenhofer A, H F Noller L. EMBO J. 1994,13:38920-39013.de Smit M H, van Duin J. J Mol Biol. 1994, 235:173-1844.Gold L, Stormo G D. Methods Enzymol. 1990, 185:89-935.Chalmberlin M J. Harvey Lect. 1994, 88:1-216.Adhya S, Gottesman M. Cell. 1982, 29:939-9447.Nishihara T, Nohno T. Gene. 1994, 145:145-1468.Landicak R, Turnbough C L. Transcription Attenuation. 1996, p1263-12869.Berg K L, Squires C, Squires C L. J Mol Biol. 1989, 209;345-35810.Olins P O, Rangwala S H. Gene. 1988, 73:227-23511.McCarthy J E G, Schairer H U, Sebald W. EMBO J. 1985, 4:519-52612.Enfors S O. Trends Biotechnol. 1992, 10:310-31513.Aristidou A A, Yu P, San K Y. Biotechnol Lett. 1993, 15:331-33614.Blackwell J R, Horgan R. FEBS Lett. 1991, 295:10-1215Han N S，Tao B Y A Simple Method to Expression Soluble，HighlyActive Cyclodextrin Glycosyltransferase in Recombinant E coliJ】Biotechn o1Tech，l999，l3：63l63516.Aristidou A A, San K Y, Bennett G N. Biotechnol Bioeng 1994, 44:944-95117Margret B. Einarson, Elena N. Pugacheva, and Jason R. Orlinick。Preparation of GST Fusion Proteins。CSH Protocols; 2007; doi:10.110118Donovan R S，Robinson C w，Glick B ROptimizing the Expressionof a Monoclonal Antibody Fragment under the TranscriptionalControl of the Escherichia coli Lac PromoterJCanJMicrobio1，2000，46(6)：53254 1 7 Takash i Okamoto, Kanako H iguch i, Takash i Sh inkaw a et al. Identification ofM ajor P roteins inM aize Egg Cells P lant CellJ . Physiology. 2004, (10) : 14061412. 8 F rank Hochholdinger, L ing Guo, Patrick S. Schnable. L ateral roots affect the p roteome of the p rimary root of maize J . P lant Molecular B iology. 2004, ( 56) : 397412. 9 Chang, Huang,L Shen. Patterns of p rotein synthesis and tolerance of anoxia in root tip s of maize seedlings acclimated to a low - oxygen environment, and identification of p roteins by mass spectrometryJ . P lant Physiology. 2000, (122) : 295318.10 M ajeran W , Cai Y, Sun Q , van W ijk KJ. Functional differentiation of bundle sheath and mesophyll maize ch lorop lasts determ ined by comparative p roteom ics J . P lant Cell. 2005, 17(11) : 31- 40. 11 Patricia M. Lonosky, Xiaosi Zhang, V asant G. Honavar et al. A P roteom ic A nalysis of M aize Ch lorop last B iogenesis J . P lant Physiology. 2004(134) : 560574. 12 W illiam W. P. Chang, L an Huang,M in Shen et al. Patterns of P rotein Synthesis and Tolerance of A noxia in Root T ip s of M aize Seedlings A cclimated to a Low - Oxygen Environment, and Identification of P roteins by M ass Spectrometry J . P lant Physiology 2000, (122) 295317: 13 Sonia Campo,Montserrat Carrascal,M aria Coca et al. The defense response of germ inating maize embryos against fungal infection: A p roteom ics app roach J P roteom ics. 2004, (4) : 383396.(a) Promoter-associated RNA is required for RNA-directed transcriptional gene silencing in human cells . Jiang Han*, Daniel Kim, and Kevin V. Morris PNAS | July 24, 2007 | vol. 104 | no. 30 | 12422-12427(b) EnhancerPromoter Communication at the yellow Gene of Drosophila melanogaster: Diverse Promoters Participate in and Regulate trans Interactions Anne M. Lee* and C.-ting Wu Genetics, Vol. 174, 1867-1880, December 2006( c) Selective Promoter Recognition by Chlamydial 28 Holoenzyme Journal of Bacteriology, November 2006, p. 7364-7377, Vol. 188, No. 21( d) Rho-dependent terminators and transcription termination M. Sofia Ciampi Microbiology 152 (2006), 2515-2528;(e ) Interaction of yeast RNA-binding proteins Nrd1 and Nab3 with RNA polymerase II terminator elements Kristina L. Carroll1, Rodolfo Ghirlando2 RNA (2007), 13:361-373（ f）Characterization of the metal ion binding site in the anti-terminator protein, HutP, of Bacillus subtilis。Thirumananseri Kumarevel, Hiroshi Mizuno, and Penmetcha K. R. Kumar。Nucleic Acids Res., Sep 2005; 33: 5494 - 5502.( g) Structural analysis of the human respiratory syncytial virus phosphoprotein: characterization of an -helical domain involved in oligomerization Mara T. Llorente, Blanca Garca-Barreno, Miguel Calero, J. Gen. Virol., Jan 2006; 87: 159 - 169.(h) Increase in ampC promoter strength due to mutations and deletion of the attenuator in a clinical isolate of cefoxitin-resistant Escherichia coli as determined by RTPCR Dobryan M. Tracz, David A. Boyd, Louis Bryden, J. Antimicrob. Chemother., May 2005; 55: 768 - 772. (i) Differences in the DNA sequence of the translational attenuator of several constitutively expressed erm(A) genes from clinical isolates of Streptococcus agalactiae Esther Culebras, Iciar Rodrguez-Avial, Carmen Betriu, and Juan J. Picazo J. Antimicrob. Chemother., Nov 2005; 56: 836 - 840.（j）The functional analysis of insulator interactions in the Drosoph