用Box-Behnken法从金丝桃属植物中提取无溶剂多酚的优化.doc

采用Box-Behnken法实验设计和动力学从金丝桃属植物triquetrifolium Turra 中提取有机无溶剂多酚的优化摘要 金丝桃属植物triquetrifolium Turra 是一种富含具有生物功能的酚类植物化学物质的植物。从这种材料中高效获取多酚在以前没有被全面深入地研究过，就建立一个环保和成本效益好的过程而言，应致力于生产富含多酚类化合物的提取物。本研究的目的是测试用水/甘油混合物从金丝桃属植物的风干部分中提取多酚的效率以及与用水提取的比较。虽然提取温度和时间使用响应面优化方法,但是是用动力学比较评估水/甘油混合物和水之间的提取效率。结果表明,10%(w / v)水甘油在70时提供了非常满意的总多酚提取率(54.83毫克没食子酸当量每克干重),这是明显高于水的获得率(17.3%)。类似结果表明，其还原能力与多酚浓度也有类似关系。液相色谱-光谱法分析表明,水/丙三醇提取的简单基团是由极性物质组成,如绿原酸、槲皮素苷。关键字 提取 甘油 金丝桃属植物triquetrifolium Turra 多酚类物质符号列表 Cgl 甘油浓度(% w / v)De 扩散(m2s-1)Dw 干重(g)H 初始萃取速率（mg g-1min-1)K 萃取速率常数(g mg-1min-1)PR 还原能力(mol AAE g-1dw)T 时间(min)tR 达到常规政权所需的时间(min)T 温度(C)YTP 总多酚提取率(mg GAE g-1 dw)YTP(s) 饱和总多酚提取率(mg GAE g-1 dw)希腊字母 介电常数(无量纲)缩写AAE 抗坏血酸当量EtOH 乙醇GAE 没食子酸当量LC-DAD-MS 液体chromatography-diode array-mass光谱法TP 总多酚TPTZ 2、4、6-Tripyridyl -三嗪介绍药用植物的工业开发与精细化学品的恢复和宝贵的代谢物的生产紧密相关，如天然抗氧化剂,一种在制药、化妆品和食品行业很有意义的高附加值产品。为了满足市场需求和低成本生产,寻找药用和芳香植物作为具有成本效益的多功能植物化学物质的来源是为了开发具有丰富的内容和成分的材料，部署有效的回收过程和确定新的生产配方以确保没有进一步的浪费。在这方面,低成本的、获取目标化合物的无毒溶剂系统的使用变得迫在眉睫。金丝桃属植物在温带地区广泛分布,大约包含了450种。在金丝桃属植物中，h.叶连翘，也称为圣约翰草,它的治疗使用和商业价值是被高度赞赏的,几十年来这种植物的各种准备工作一直用于治疗一系列的疾病,这归功于它与高含量的各种生物活性代谢产物的有利结合,分布广泛和长久的传统药理学历史。然而,其他金丝桃属植物物种,也可能具有重要的药理价值,但没有仔细研究,甚至被忽视。因此,有关从一种具有药理药效的金丝桃属植物成分triquetrifolium Turra提取多酚类的资料非常稀缺。最近的研究表明,甘油,一种天然,无毒和低成本的物质,可以积极改变水的极性,作为一种有效的共溶剂增加多酚采收率。甘油的介质常数可与甲醇和乙醇相比，且比水小,所以可减少水的极性以更适合多酚的高效提取。在这个框架中,这项研究的范围是彻底地调查以水/甘油作为媒介从h . triquetrifoliumTurra的空干部分提取多酚的潜能，研究应使用一个基于响应表面的方法和动力学精心设计的过程。获得的最优提取物是经液体色谱-光谱法(质)分析能够初步确定主要多酚的植物化学物质。实验步骤化学药品和试剂所有用于色谱分析的溶剂应是高效液相色谱级。六水三氯化铁是标准品(美国新泽西州)。没食子酸、抗坏血酸Folin-Ciocalteu试剂和2、4、6-tripyridyl -s-三嗪(TPTZ)是标准试剂(Steinheim,德国)。甘油是费舍尔科学(美国新泽西州)。植物材料在这项研究中使用的植物是由M.A.I.Ch. Herbarium (Chania克里特岛)提供的h . triquetrifolium Turra的空干部分，M.A.I.Ch. Herbarium是一个证据标本存放的地方(herb. number 9224)。收集后,植物组织在干燥和暗室中在室温下晾干，为期7天,然后磨成细粉(近似平均颗粒直径0.5毫米)，使用国内搅拌器(Bosch MMB 112 r)。这个材料将用于所有进一步的程序。提取过程取数量大约1克的干燥物,被研磨过的材料被放置在一个有50毫升的萃取剂的100毫升玻璃瓶中，萃取剂由去离子水或10%(w / v)水甘油组成。甘油比例的选择是基于之前的测试和初步实验。抽取在电磁搅拌器以400 rpm搅拌及预定的时间段进行。提取时，玻璃小瓶沉浸在油浴,通过热板加热（(YellowLine MST Basic C, Richmond, VA, USA），设定在50、60和701.5C。YellowLine TC1恒温器控制温度。定期完成抽样(5、10、25、50和95分钟),获得的提取物是透过纸过滤和在20C储存直到进行分析。所有提取物也透过0.45 -m注射器过滤器测试。测定总多酚的产量(YTP)在1.5毫升埃普多夫管内,添加0.78毫升蒸馏水,0.02毫升的样品适当稀释,和0.05毫升的Folin-Ciocalteu试剂(最终浓度0.1米)，充分混匀。1分钟后,添加20%0.15毫升的水碳酸钠,充分混匀,室温下黑暗中静置60分钟。750nm下读取吸光度值,总多酚浓度参照校准曲线计算,利用没食子酸绘制标准曲线。 结果表示为毫克没食子酸等价物(GAE)每克干重。总多酚产量(YTP)计算如下：YTP=(mgGAEg1）=（cv)/m （1）C:提取物的TP浓度(mgL1)；v:提取介质的体积(L)； m:植物材料的干重(g)还原能力的测定（PR)在酸性介质中，分析测定抗氧化物还原Fe(III)-TPTZ3产生蓝色Fe(III)-TPTZ2的能力。PR值是通过测量在620 nm吸光度,然后将其与抗坏血酸标准溶液相关联,抗坏血酸是一种天然强还原剂。因为这个还原能力的测定方法是基于铁离子的还原性，所以它是特定于多酚的抗氧化剂。根据先前完成的测试作出了最终方案。取适量样品(0.05毫升）用甲醇稀释后与0.05 mL FeCl3 溶液(4.03 mM 溶于 0.05 M HCl）充分混匀，在37 水浴中反应30min. 这之后,加入0.9毫升TPTZ溶剂（1mM溶于0.05M盐酸),5分钟后，在620nm处读取吸光度。PR可确定为mol抗坏血酸等价物(mol AAE) / g dw。Box-Behnken试验设计和响应面法提取过程有关温度（T）和时间（T)的优化通过Box-Behnken试验设计完成。两个独立的变量(T和t)被编为三个水平，-1,0,1（表1），根据以下方程： xi=(Xi-X0)/Xi, XI=1,2 (2)表1用来做Box-Behnken试验设计的独立变量的实验值和测试水平在这里，xi。XI表示独立变量i的无量纲和实际值；X0 表示独立变量i在中心点时的实际值；Xi表示Xi的一个单位的无量纲值的单增量改变值。每个设计点的响应值（YTP)被记录在表2.表2测量和预测YTP决定单独的设计点获得的数据使用最小二乘回归分析方法，列出方程得到响应值独立变量的函数(数学模型)。方差分析（ANOVA）是用来评估统计学意义的模型。意义是通过后向消除法的过程改进,通过省略无关紧要的相关术语(p 0.05)。通过维护独立变量，使用拟合模型获得了响应曲面图。通过动力学比较水/甘油和水的临界萃取过程。出于这个原因，正如前面提到的，考虑到极限条件（t=0,YTP=0），使用二阶模型：YTP（t)(3)YTP(S)和k分别代表了TP在饱和时的获得量和萃取速率常数。拟合曲线符合统计学意义(R2 0.99,p 0.0001)。Eq的转换（3）提供了一个直线方程： （4） 当t接近0，提取率h可看作YTP(t)/t,可表达为：绘制t图，可得到一条形式的直线（图2),其中，因此，测出每一次的数据后，和h可由图像获得.所有溶液测试后，若 t/YTP(t) 之间的相关性(t)非常高,具有统计学意义(R20.99,p 0.0001),这便可作为可靠的动力学参数(表3)图1.从h . triquetrifoliumTurra提取的TP，YTP与t值间无线性相关。提取在条件为搅拌速度400 rpm, 70 C 和固液比例为 50 mL g-下进行1图2从h . triquetrifoliumTurra对TP的二阶动力学提取。提取在条件为搅拌速度400 rpm, 70 C 和固液比例为 50 mL g-下进行当提取效率接近80%时，动态趋势由快到慢。这个时间框架,称为“常规阶段”,表现了提取的缓慢阶段的特征,这期间萃取率增加较慢。提取过程所需达到常规阶段的时间，tR,可由下列方程式得到： （6）tR可由Eq确定，也在表3中给出。 基于菲克第二定律的数学表达式,YTP和有效扩散的溶质(多酚)的关系式可以描述如下: （7）De表示有效扩散系数(m2s1)，R表示粒子半径。然而，假设经过短萃取期间，只有这些溶液的最先阶段的数据被认为是有意义的；故，Eq可被写作： （8）所以，Eq的线性化方程是： （9） 绘制t(表3）后，De可由图中直线的斜率计算获得（斜率=)。图画好后，可以观察到,在某些情况下,点分散在两相交直线,一个在直线上方，一个在直线下方。因为第一行对应于提取的快速阶段（洗涤），它可以被视为非限制性的阶段，在这项研究中的De系数可通过确定扩散过程缓慢阶段的斜率计算，这可能与萃取介质的效果有关。表3 二阶动力学参数,确定了在70使用两种不同的萃取介质从h . triquetrifolium Turra,TP的提取 定性液相色谱-二极管阵列检测器-质谱联用方法 先前报道的改进的方法已被使用。在Finnigan MAT谱系统，用了P4000泵，再加上UV6000LP二极管阵列检测器和一个菲尼根AQA质谱仪。分析在封端Superspher RP-18，12592毫米，4lm系列色谱柱（德国默克公司）上进行，需有人看护，柱填充有同样的材料，并保持在40。进行分析时在正离子模式下使用喷雾电离质谱（ESI），采集设定在10和70伏特，毛细管电压为4kV，源极电压25 V，检测电压650 V和探头温度400。洗脱液（A）和洗脱液（B）分别为2.5乙酸和甲醇。流速为0.33毫升mL min-1，所使用的洗脱程序为如下：0-2分钟，0B; 2-20，60B; 40，40B; 60，40B. 统计分析所有测定至少进行一式三份，取平均值。响应面实验设计和统计数据用JMPTP10进行。动力学由YTP和t之间的非线性关系建立。非线性回归被用SigmaPlotTM进行12.0，至少在95的显着性水平。结果与讨论响应面优化独立变量（X1和X2），以及测量和预测的响应（YTP）值，被解析示于表2。YTP的值由实验获得，通过多元回归分析和除去非显著因素后（p0.05）,理论模型如下： (10)拟合的意义用相关系数的平方（R2）来检查，其为0.93（p值=0.0198）。这一结果表现了观察和预测的响应之间令人满意的一致性，且该方程有效地预测了实验结果。该模型的应用程序可允许理论计算环境条件最优值，即T = 70 C ，t = 73.0 min。在这些条件下，YTP的最优值是54.23 5.42 mg GAE g-1dw。确定的趋势记录在一个三维的形式图（图3）图3响应面图显示变化YTP作为一个功能在t和t同时变化。萃取在条件为10（重量/体积）甘油水溶液，在50毫升克液体 - 固体比例下进行 动力学 植物材料的溶剂萃取包含了扩散现象，被认为有三个阶段：（1）.溶剂侵入质量固体颗粒和提取化合物的增溶（快速，非速率限制）；（2）在溶解时，从内粒子化合物与固体/液体界面的扩散，称为内扩散（慢，速率限制);（3）溶解的化合物从固体/液体界面进入溶液的扩散，称为外扩散（一般认为非速率限制）。根据菲克第二定律，最后两个步骤发生是由于浓度梯度。从固体颗粒进入通过该溶液的扩散过程中，多酚类物质浸出，而且，在饱和条件下，YTP保持不变，二阶萃取动力学指示两次提取阶段：首先，扩散快速最有可能是由于极性酚的快速增溶和高浓度梯度；其次，扩散减慢，是因为较低浓度梯度和极性较小的或较不容易提取的化合物所需的提取时间较长。这种现象可能已经观察到了，因为可提取组分的最初的洗涤在固体颗粒的外表面发生，而设在颗粒化合物的提取主要由内部扩散控制。这个阶段末尾时，当正在接近YTP(S)，缓慢内扩散可能是溶质 - 溶剂复合物转移到提取过程的限速因素。根据动力学，设立对照实验，验证假设。动力学通过YTP和t之间的非线性回归建立，用于通过水和10（重量/体积）甘油在70的萃取，以确定这是提取过程的描述性的动力学参数。总体而言，用水提取比用水-甘油混合液快，使k值与 0.015 和0.012 g mg-1min-1的条件（表3）相一致，可更快到达常规阶段(tR = 1.51 min)。然而，最初的提取率用水-甘油是35.15mg g-1，用水是29.18mg g-1。同样，用水-甘油萃取的扩散速率也比水快，它们的值分别是1.78 10-11m2 s-1和 1.52 10-11m2 s-1，并且用10%水-甘油有高17.3%的YTP提取率。考虑到内部扩散是限速步骤，它可能被认为在水溶液中，多酚在固体颗粒内扩散更快。然而，10（W / V）甘油可获得更高YTP(S)是一个明显的证据表明水-甘油是一种更有效的溶剂，它可能因可提取较大范围的化合物而被青睐。 用定性LC-DAD-MS法努力进一步说明这样一个假说以获得一些关于提取物性质的信息。含量最丰富的的提取物通过LC-DAD-MS得到的分析显示11个主要植物化学物质的存在（表4）。根据以前的信息，这些成分被初步确定为羟基肉桂衍生品（峰1-6）和黄酮醇苷（峰7-11）。这一发现与研究报道的H. triquetrifolium的主要多酚植物化学物质是咖啡因-和肉桂酰奎尼酸缀合物和槲皮素糖苷是一致的，但也与与贯叶连翘样本检测结果一致。值得注意的是，一些金丝桃物种的其它特征成分，即金丝桃素和hyperforins，没有检测到。因为这些提取物中的化合物特征与其它酚相比有着相当少的极性，通过重获大多数极性成分，它可以有选择性地出现在两用于萃取媒介。事实上，用甘油水溶液提取橄榄叶酚醛树脂，相比于用水/乙醇的混合物，被发现可提取更多极性物质，这个现象归因于两个萃取溶剂之间的极性差异。依着这样的证据，它支持用水提取可取得更高的速率，这最可能是由于极地咖啡酰结合物的快速清洗。与此相反，用水-甘油萃取可更高效获得YTP(S)值，大概是由于低极性化合物的增溶（黄酮苷），咖啡酰缀合物除外。这种假设可以很好的证实，考虑到甘油介电常数=42.5和可以有利地改变水的介电常数（=80.1），使其降低极性以更高效提取多酚。用各种溶剂在咖啡废渣提取时，这种效应已经被观察到，其中，水/乙醇混合物在提取多酚比水更有效。因此，甘油水溶液被认为是比水更有效的萃取介质相，这大概是因为它较小的. 抗氧化活性 在70 下提取90min后，YTP达到最大值（54.83 mg GAE g-1dw）。据先前报道，这接近44.50 mg GAE g-1dw级别。所有在Htriquetrifolium Turra提取中发现的类多酚物质都已被证明表现出明显的抗氧化性能，最有效的为槲皮甙和甙元槲皮素。据各种多元酚获得材料研究报道，PR是抗氧化剂的评价活性的可靠标准，其中一个统计学显著证明多酚和PR的量之间的相关性。贯叶连翘提取物剂量减少的影响