消毒剂消毒效力检测方法验证方案.doc

概述：本公司现使用四种消毒剂进行消毒，分别为酸性苯酚，碱性苯酚，杀孢子剂和75%乙醇，根据其使用目的和使用条件的不同选择不同的检测消毒剂效力的方法。为确保能够准确检测消毒剂的消毒效力现对消毒剂消毒效力的检测方法做出验证。目的：消毒剂消毒效力检测方法有两种，为表面试验法和定量悬浮试验法，通过验证表面试验法和定量悬浮试验法中中和剂中和效力的挑战性试验以及用于检测样品中的微生物的方法的促菌生长能力（试验方法的灵敏度）。范围：适用于检测酸性苯酚，碱性苯酚，杀孢子剂，75%乙醇的消毒效力检测方法。验证小组成员及职责验证小组成员：部门人员验证领导小组QC职责：由化验室操作人员起草方案；化验室负责人及质保部负责人审核；验证委员会批准后由相关操作人员执行验证委员会批准后由化验室操作人员执行。验证过程应严格按照规定的内容执行，若因特殊原因确实需要变更时，应填写验证方案变更申请及批准书，报验证委员会批准。验证过程应严格按照规定的内容执行，若因特殊原因确实需要变更时，应填写验证方案变更申请及批准书（附表1），报验证委员会批准。验证进度安排验证时间：2012年6月15日2012年6月30日。验证依据及验证方案变更申请及批准书：有（见附页） 无参考文献1药品生产验证指南（？年版） 2消毒技术规范（2012年版） 3中国药典（2010年版）4药品微生物学检验技术验证内容1器材与试剂 1.1培养基（见培养基配制记录 ）1.2稀释液：1%蛋白胨-PBS溶液 1.3中和剂：0.1%卵磷脂+1%吐温80溶液1.4无菌载片：5cm的正方形不锈钢片，：5cm的正方形玻璃片1.5无菌试管 50ml、无菌平皿(90mm)、含玻璃珠的无菌三角瓶、计时器、净化工作台、漩涡混合器、恒温培养箱1.6消毒剂：75%酒精，酸性苯酚，碱性苯酚，杀孢子剂，甲酚皂，新洁尔灭。1.7移液器及配套无菌吸头:0-100ul，100-1000ul 2中和剂鉴定试验(实验结果见附表2)2.1试验目的：:通过该试验，确认所用的中和剂对对应的消毒剂有良好的中和作用，中和剂本身及其与消毒剂的反应产物应对微生物无抑菌或杀菌作用切对微生物的生长无影响。2.2菌液的制备及计数取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌的新鲜培养物用0.9无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释成约108CFU/ml的工作菌液。计数时，将约108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀释成含50100CFU/ml菌液，并同时采用营养琼脂培养基3035培养3天计数。计算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成菌液浓度。白色念珠菌工作菌液的制备，取白色念珠菌的新鲜培养物用0.9无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释成约108CFU/ml的工作菌液。计数时，将约108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀释成含50100CFU/ml菌液，并同时采用改良马丁琼脂培养基2328培养5天计数。计算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成菌液浓度。2.3鉴定试验操作2.3.1消毒剂：配制75%乙醇、酸性苯酚，碱性苯酚，杀孢子剂，甲酚皂，新洁尔灭。2.3.2试验分组及稀释操作方法简表组号混合液A混匀作用10min混合液B混匀作用10min取混合液B或混合液B的稀释级溶液0.5ml平板计数（2皿/组）取0.5ml工作菌液加入下列溶液中取混合液A 0.5ml加入下列溶液1消毒剂4.5ml稀释液4.5ml混合液B、10-12消毒剂4.5ml中和剂4.5ml混合液B、10-13中和剂4.5ml稀释液4.5ml10-2、10-34中和产物4.5ml（消毒液与中和剂比例为1:1）稀释液4.5ml10-2、0-35稀释液4.5ml稀释液4.5ml10-2、10-36稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿。2.3.3具体操作2.3.3.1第1组目的：观察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力。操作：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液0.5ml+稀释液4.5ml，混匀作用10min，取0.5ml注皿，平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置2328培养5天计数计数。2.3.3.2第2组目的：观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长。操作：取消毒剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min后，取混合液0.5ml +中和剂4.5ml，混匀作用10min，用稀释液稀释成10-1。分别取未稀释溶液（混合液0.5mll+中和剂4.5ml的混合液）及10-1 0.5ml注皿，各平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置于2328培养5天计数。2.3.3.3第3组目的：观察中和剂是否有抑菌性操作：取中和剂4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置2328培养5天计数。2.3.3.4第4组目的：观察中和产物，或未被完全中和残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。操作：取消毒剂和中和剂1:1的混合液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置2328培养5天计。2.3.3.5第5组目的：作菌落数对照用操作：取稀释液4.5ml+工作菌液0.5ml，混匀作用10min，取混合液0.5ml l+稀释液4.5ml，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级0.5ml注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置2328培养5天计数。2.3.3.6第6组目的：作为阴性对照用操作：分别取稀释液和中和剂各1.0ml注入无菌平皿中，各制备2皿。2.4判断标准合以下条件的中和剂表明可消除消毒剂对试验菌的作用，中和剂及其与消毒剂中和产物对试验菌无影响。该中和剂合格。2.4.1第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长。2.4.2第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少，且符合下表要求第1组平板平均菌落数第2组平板平均菌落数05x(x+5)y(y+0.5y)2.4.3第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超过10%。计算公式如下：2.4.4第6组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应重新进行试验。3表面试验法方法验证3.1目的：验证表面试验法的灵敏度（包括接触碟法和棉签擦拭法）3.2菌液的制备及计数取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌的新鲜培养物用0.9无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释成约10-100CFU/ml的工作菌液。计数时， 取工作菌液1ml采用平皿法进行计数，用营养琼脂培养基3035培养3天计数，每个试验菌制备2个平皿，并同时计算工作菌液浓度 取白色念珠菌的新鲜培养物用0.9无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释成约10-100CFU/ml的工作菌液。计数时，取工作菌1ml采用平皿法进行计数，用改良马丁琼脂培养基2328培养5天计数。每个试验菌制备2个平皿，并同时计算工作菌液浓度 3.3接触碟法验证结果见附表33.3.1取10-100CFU/ml工作菌液1ml均匀涂布于无菌载片上，在超净工作台上吹干，吹干后立即用已制备好的无菌接触碟按压载片数秒，使接触碟与载片完全接触，每种菌制备两个接触碟。另取10-100CFU/ml工作菌液1ml加入到1ml中和产物（消毒剂与中和剂1:1）中，充分混合后均匀涂布于无菌载片上，在超净工作台上吹干，吹干后立即用已制备好的无菌接触碟按压载片数秒，使接触碟与载片完全接触，每种菌制备两个接触碟。同时做阴性对照。细菌于30-35培养3天计数，真菌于2328培养5天计数。计算每种菌的平均菌落数。3.3.2回收率计算：回收率=菌液组菌落数/中和产物组菌落数100%3.3.3可接受标准:回收率70%，阴性对照为阴性3.4试子擦拭法：结果见附表33.4.1取样程序：取样人员用经过灭菌处理的生理盐水润湿经过灭菌处理的棉签，并将其靠在溶剂瓶上挤压，以除去多余的溶剂；将棉签按在取样表面上，用力使其稍弯曲，按图A，平稳而缓慢地擦拭取样表面。在向前移动的同时将其从一边移到另一边。擦拭过程应覆盖整个表面。翻转棉签，按图B，让棉签的另一面也进行擦拭。但与前次擦拭移动方向垂直，见下图：3.4.2取10-100CFU/ml菌液1ml均匀涂布于无菌载片上，在超净工作台上吹干，吹干后立即用已用无菌生理盐水润湿的试子擦拭载片，将试子取得的样品放置于10ml中和剂中，漩涡震荡1分钟，然后用薄膜过滤法计数，每种菌制备两个平皿，另取10-100CFU/ml菌液1ml加入到1ml中和产物（消毒剂与中和剂1:1）中，充分混合后均匀涂布于无菌载片上，在超净工作台上吹干，吹干后立即用已用无菌生理盐水润湿的试子擦拭载片，将试子取得的样品放置于10ml中和剂中，漩涡震荡1分钟，然后用薄膜过滤法计数，每种菌制备两个平皿，同时做阴性对照。细菌于30-35培养3天计数，真菌于2328培养5天计数。计算每种菌的平均菌落数。3.4.3回收率计算：回收率=菌液组菌落数/中和产物组菌落数100%3.4.4可接受标准:回收率70%，阴性对照为阴性4定量悬浮试验方法验证（定量悬浮试验；就是将一定量的试验菌直接接入消毒剂的工作稀释液中以评估消毒剂的杀菌效力）结果见附表34.1目的：为了确保在消毒剂工作稀释度下残留菌生长检测方法的可靠性和准确性，必须要做中和试验。4.2菌液制备同2.24.3方法：薄膜过滤法将100ml中和剂倒入滤杯中，取10-100CFU/ml菌液1ml加入滤杯中过滤，每种菌制备两个平皿，按薄膜过滤法计数，另取10-100CFU/ml菌液1ml加入到100ml中和产物（消毒剂与中和剂1:1）中过滤，每种菌制备两个平皿，按薄膜过滤法计数，同时做阴性对照。细菌于30-35培养3天计数，真菌于2328培养5天计数。计算每种菌的平均菌落数。4.4回收率计算：回收率=菌液组菌落数/中和产物组菌落数100%4.5可接受标准:回收率70%，阴性对照为阴性5再验证周期消毒剂的厂家变更，检测方法等改变时，均需进行再验证，周期性验证每3年进行一次66偏差及处理措施6.1目的：建立偏差及处理措施，使验证规范化、标准化和程序化。6.2内容：6.2.1一切与本验证方案有偏离的均需填写验证的偏差报告，写明偏差的原因，及采取的措施，根据偏差的原因和对验证结果的影响采取相应措施。6.2.2偏差统一编号管理，与本验证相关的偏差复印后放验证报告中。7验证结果评定与结论验证领导小组根据验证情况对验证结果进行综合评审，做出验证结论，填写验证总结报告，由验证委员会做出是否批准的决定及负责发放验证证书。a) 验证试验是否有遗漏？b) 验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因，依据以及是否经过批准？c) 验证记录是否完整？d) 验证试验结果是否符合标准要求？偏差及对偏差的说明是否合理？是否需要进一步补充试验？附表1消毒剂名称消毒剂批号消毒剂的工作浓度备注中和剂名称中和剂批号稀释剂名称稀释剂批号附表2中和剂鉴定试验消毒剂名称：名称金黄色葡萄球菌编号铜绿假单胞菌编号枯草芽孢杆菌编号白色念珠菌编号大肠杆菌编号第1组第2组第3组第4组第5组第6组判断标准第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长。第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少，且符合下表要求第1组平板平均菌落数第2组平