ELISA试剂盒检测中样品的处理.docx

ELISA试剂盒检测中样品的处理/各种检测样本的处理1细胞培养物上清： 细胞培养物于室温1000g，离心10分钟后收集上清，并将标本保存于-20，且应避免反复冻融。2血清： 标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000g，4离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。3血浆： 可用EDTA或肝素作为抗凝剂标本采集后30分钟内于2-8,1000g离心15分钟，或将标本放于-20保存，但应避免反复冻融。4尿液： 无菌收集取初尿，离心除去沉淀物，即可用于检测，要长期保存尿样，可以加入0.05的NaN3在4-8保存，或加入尿样冰冻保护液放入-20冰箱长期保存。5组织匀浆： 将组织标本先用PBS洗涤，除去多余血液，匀浆化后放在PBS于-20放置过夜，再经过二次反复冻融破膜，5000g，4离心5分钟，取上清即可检测。ELISA法定量检测人细胞液、体液以及组织匀浆中8羟基脱氧鸟苷的含量。试剂组成:包被平底微孔板,酶结合物,生物素,标准品,显色剂A,显色剂B,终止液,浓缩洗涤液（100倍稀释）,使用说明书自备物品1.酶标仪（尽量提前预热）2.微量加液器、吸头3.蒸馏水或去离子水以及滤纸样本的采集及保存一般的生物标本包括有：血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等一般为无菌操作，低温保存（-80、液氮）一如果采集的实质器官则要求：1、 器官实质不能太小2、 以采集实质性病灶区为佳：如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的地方为佳3、 同一病例装入同一容器，并做好标记4、 应在0-8的低温储存和运输5、 实质性器官的处理：5.1、取实质性器官约0.5mg左右，充分剪碎或研磨5.2、加入约500ul的PBS/生理盐水，充分混匀5.3、离心5000rmp x10min，去上清5.4、-20保存，作为待检标本（切勿反复冻融）二体液（常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等）的处理方式1、血液包括血浆和血清，它们的主要区别就是：血清凝血而血浆不凝血，所以它们的处理方式也就不一样1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂（主要为枸橼酸盐和柠檬酸盐），采集后立即离心800-1000rmp x 5min分离，取上清，-20或4保存备用；1.2、如要采集血清，一般要加入总体积1%的抗凝剂，采集后先室温或4静置半小时后，800-1000rmp x 5min分离，取上清，-20或4保存备用；2、胃液和唾液的采集方式一般现采现用，但是一般饭后半小时内不易采集，因为刚进食的唾液中富含丰富的唾液淀粉酶，最好的采集的时间时空腹采集；3、尿液的采集方式基本和唾液一样的，即现采现用，但是一般隔夜尿不采集；4、组织提取液如肺泡灌洗液等，采集后离心分离，800-1000rmp x 5min，取上清，-20或4保存备用；三粪便以及天然孔排泄物：采集后一般现用PBS/生理盐水溶解，充分混匀，800-1000rmp x 5min分离，取上清，-20或4保存备用；四活检组织一般进行穿刺检测，最常见的就是肝活检，像病毒性肝炎、脂肪肝、各种类型的肝硬化等进行活检简单方便、准确。三、表达产物的检测（一）真核表达产物1、 细胞上清（分泌性蛋白）1.2、贴壁细胞或半贴壁，直接将细胞培养上清吸出，10000rmp x10min， 取上清，-20或4保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；1.2、不贴壁细胞，将培养基和细胞转移至10ml离心管，500-800rmp x10min，吸取上清至另一10ml离心管中，10000rmp x10min， -20或4保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；2、 细胞裂解物（非分泌性蛋白）2.1、贴壁细胞或半贴壁，直接将细胞培养上清吸出，然后用001M PBS（pH 7.4）将细胞吹下至10ml离心管，500-800rmp x10min，弃上清，沉淀转移至1.5ml离心管中， DDW重悬，置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解，10000rmp x10min，取上清，-20或4保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；2.2、不贴壁细胞，将培养基和细胞转移至10ml离心管，500-800rmp x10min，弃上清，沉淀移至另一10ml离心管中，0.01M PBS（pH 7.4）重悬，500-800rmp x10min，弃上清，沉淀移至1.5ml离心管中， DDW重悬，置冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解，10000rmp x10min，取上清， -20或4保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；（二）原核（大肠杆菌表达系统）表达产物1、表达上清（非融合性蛋白）直接将培养物和上清吸出，10000rmp x10min， 取上清，-20或4保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；2、菌体裂解物（融合性蛋白）直接将培养物和上清吸出，10000rmp x10min，弃上清，沉淀用PBS洗一遍，500-800rmp x10min，弃上清，DDW重悬沉淀，冰水浴中用超声波裂解仪进行裂解，10000rmp x10min，取上清，-20或4保存，作为标本进行检测，如有需要可进行透析或纯化处理；注意事项1.试剂准备：所有试剂都必须在使用前达到室温，使用后请立即按照说明书要求保存。实验操作中必须使用一次性吸头，避免交叉污染。2加样：加样时，要控制加样速度，避免第一孔与最后一孔之见的时间间隔过大，否则将会导致不同的预孵育时间，从而影响实验的准确性以及重复性；一般加样时间控制在10分钟内，如果样本数量过多，可使用多道移液器。3.孵育：样品要在密闭的容器内进行孵育，严格按照说明书上规定的孵育时间和温度进行。4.洗涤：洗涤过程中反应孔中的残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，同时要消除板底残留的液体和手指痕迹，避免影响最后的酶标仪读数。5.反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，10分钟左右），如果颜色较深，请提前加入终止液终止反应。6.建议实验前预测样品含量，如样品浓度过高，应对样品进行稀释，计算结果时乘以相应的稀释倍数。7.建议使用本试剂盒时先做预实验（即先做标准曲线，试用几个标本），如果对本试剂盒有任何疑问，可和所购经销商联系，如果因运输过程导致试剂盒失效，可要求调换，但概不承担产品本身以外的任何损失。操作步骤1. 取出试剂盒，于室温（20-25）放置15-30分钟。实验过程应在室温（20-25）内进行。2. 取出酶标板，按照标准品的次序分别加入50l的标准品溶液于空白微孔中。3. 空白微孔中加入50l的样品，空白对照加入50l的蒸馏水；4. 在样品孔中加入10l的生物素；（不含空白对照孔,切忌：生物素只加样品孔！）5. 在各孔中加入100l的酶标记溶液；（不含空白对照孔）6. 将酶标板用封口胶密封后，37孵育反应 1小时；（在孵育箱中保持稳定的温度与湿度）7. 充分清洗酶标板3-5次，保持各孔有充足的水压；（浓缩洗涤液以1：100的比例与蒸馏水稀释）8. 酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干；9. 各孔加入显色剂A、B